本文關(guān)鍵詞：乙肝大鼠模型建立及相關(guān)肝纖維化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球范圍影響人類健康的重要問題,目前全球慢性乙肝感染者約有4億人。HBV慢性化進(jìn)程往往伴隨著肝纖維化的發(fā)生,肝纖維化是慢性肝炎向肝硬化、肝癌發(fā)展的必經(jīng)階段。如若活動(dòng)性肝纖維化得不到有效控制,最終約10%-30%可發(fā)展為肝硬化,甚至肝癌。我國屬于HBV高流行區(qū),乙肝肝纖維化是我國常見肝纖維化原因之一。目前認(rèn)為其機(jī)制歸因于肝細(xì)胞的損傷與免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子在肝組織局部浸潤。持續(xù)HBV體內(nèi)復(fù)制可加速肝纖維的病理損傷,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在肝內(nèi)過度沉積。HBV具有非常嚴(yán)格的宿主特異性,自然狀態(tài)下僅感染人類及靈長類動(dòng)物,由于缺乏合適的HBV實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,對(duì)慢性乙肝感染及該過程中發(fā)生的肝細(xì)胞損傷機(jī)制仍缺乏深入了解。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型是目前最常用的動(dòng)物模型,這種轉(zhuǎn)基因小鼠的HBV基因整合在宿主染色體中,其自身處于免疫耐受狀態(tài),可實(shí)現(xiàn)持續(xù)HBV體內(nèi)的復(fù)制,但因其不形成HBV前基因組RNA復(fù)制的原始模板cccDNA,同時(shí)免疫耐受也不利于觀察到小鼠肝損傷后修復(fù)反應(yīng)及肝纖維化形成。而目前實(shí)驗(yàn)用肝纖維化動(dòng)物模型多采用施以不同劑量肝毒劑化學(xué)誘導(dǎo)法建模,如四氯化碳、二甲基亞硝胺、乙醇等,還包括免疫誘導(dǎo)法、膽管阻塞法及復(fù)合方法等,這些肝纖維化動(dòng)物模型具有造模簡單,成模率高,死亡率低,重復(fù)性佳等特點(diǎn),但與我國極常見的乙肝肝纖維化發(fā)病機(jī)制相差甚遠(yuǎn)。如何建立與人HBV自然狀態(tài)感染過程類似的HBV動(dòng)物模型,是研究其發(fā)病機(jī)制及治療應(yīng)用的基礎(chǔ),也是研究如何阻斷乙肝肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵。重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)是臨床治療基因病常用病毒載體之一,根據(jù)AAV8亞型的高嗜肝性特點(diǎn),本研究應(yīng)用攜帶1.3拷貝HBV基因組的重組8型腺相關(guān)病毒載體(rAAV8-1.3HBV)經(jīng)腹腔注射法導(dǎo)入SD大鼠體內(nèi),擬建立一種新型的模擬人類HBV感染及相關(guān)肝纖維化進(jìn)程的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,旨在為國內(nèi)乙肝肝纖維化研究提供新視角。方法：采用rAAV8-1.3HBV經(jīng)腹腔注射新生SD大鼠,固定時(shí)間點(diǎn)(2周、4周、8周、12周)檢測(cè)大鼠血清及肝臟中乙肝抗原(HBsAg. HBeAg)表達(dá)及HBV DNA拷貝數(shù),第12周處死并采集大鼠肝臟,制作病理切片行HE和Masson染色評(píng)價(jià)肝組織炎癥活動(dòng)度分級(jí)和肝纖維化分期,免疫組化檢測(cè)乙肝核心抗原(HBcAg)陽性肝細(xì)胞的表達(dá)情況,以及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)等肝纖維相關(guān)因子的表達(dá)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組大鼠(0日齡,6雄7雌)腹腔注射1×1011vg的rAAV8-1.3HBV,對(duì)照組注射等體積PBS溶液。2周后采用ELISA法檢測(cè)血清中HBsAg、HBeAg,實(shí)驗(yàn)組雄性3820±828IU/mL,雌性3369±1581IU/mL, HBeAg分別為133±46 NCU/mL和7771 NCU/mL,乙肝抗原均為強(qiáng)陽性,感染率100%;4周、8周時(shí)血清HBsAg、 HBeAg仍為陽性,但HBeAg下降趨勢(shì)較明顯：12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組HBsAg顯示呈弱陽性.HBeAg基本為陰性(n=11,84.6%),對(duì)照組乙肝抗原檢測(cè)全陰。熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠血清及肝臟HBV DNA拷貝數(shù),2周時(shí)血清HBV DNA波動(dòng)于2.95×106至8.27×104copy/nmL,個(gè)體間存在差異,總體雄性略高于雌性,隨時(shí)間變化拷貝數(shù)緩慢下降,但12周時(shí)仍維持較高拷貝數(shù)；第12周檢測(cè)肝臟HBV DNA拷貝數(shù)明顯高于同期血清含量(p0.001)。第12周處死大鼠取肝臟做病理切片。HE染色見實(shí)驗(yàn)組普遍出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、點(diǎn)灶狀壞死及嗜酸性變,匯管區(qū)擴(kuò)大及淋巴細(xì)胞浸潤炎性改變。Masson染色見匯管區(qū)周圍纖維化,有不同程度纖維間隔形成,無假小葉形成。肝臟免疫組化證實(shí)肝內(nèi)存在HBcAg陽性細(xì)胞,這直接證明了rAAV8-1.3HBV注射建模法可感染大鼠肝細(xì)胞并持續(xù)進(jìn)行HBV肝內(nèi)復(fù)制。免疫組化同時(shí)觀察到TGF-β1細(xì)胞因子的陽性表達(dá),提示該模型已啟動(dòng)乙肝肝纖維化進(jìn)程。結(jié)論：經(jīng)檢索國內(nèi)外尚無此類大鼠模型的報(bào)道。本項(xiàng)目首次利用rAAV8-1.3HBV體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)法建立HBV大鼠模型,并在觀察期12周內(nèi)監(jiān)測(cè)到乙肝抗原表達(dá)和HBV體內(nèi)復(fù)制,并觀察到HBV大鼠模型肝組織炎性改變及肝纖維化進(jìn)程。該動(dòng)物模型的應(yīng)用價(jià)值及創(chuàng)新點(diǎn)在于造模簡單,能較好模擬人類HBV感染過程及肝纖維化形成。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 肝纖維化 腺相關(guān)病毒 大鼠模型
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.62;R-332
【目錄】：

• 中英文縮略表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一部分 rAAV8-1.3HBV載體的制備與滴度檢測(cè)14-22
• 1 材料與方法15-17
• 2 結(jié)果17-20
• 3 討論20-22
• 第二部分 乙肝肝纖維化大鼠模型的建立22-42
• 1 材料與方法22-26
• 2 結(jié)果26-39
• 3 討論39-42
• 參考文獻(xiàn)42-46
• 綜述46-54
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章54-55
• 致謝55

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 董小巖;尉遲捷;王剛;田文洪;陸月;張風(fēng)衛(wèi);王文;王岳;譚文杰;吳小兵;;高嗜肝性8型重組腺相關(guān)病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)法制備乙型肝炎病毒持續(xù)感染小鼠模型[J];病毒學(xué)報(bào);2010年06期

2 李瑗;蘇建家;楊春;曹驥;歐超;梁亮;楊芳;王琦;;乙型肝炎病毒樹，

本文編號(hào)：353822