本文關(guān)鍵詞：結(jié)核桿菌脂質(zhì)抗原對人外周血單個核細胞的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景及目的:結(jié)核病(TB)是我們?nèi)祟愐阎淖罟爬系膫魅静≈?結(jié)核分枝桿菌(M.tb)是主要致病因素,所以尋找有效的抗M.tb藥物或者疫苗一直是各國研究的重點之一。但是,至今其預防和治療仍不盡人意。雖然,現(xiàn)有的商業(yè)疫苗已經(jīng)有了卡介苗(BCG),其對于兒童感染的TB預防是有效的,尤其是較嚴重類型TB(如結(jié)核性腦膜炎、粟粒性結(jié)核病),但是其對保護成人肺結(jié)核方面缺乏穩(wěn)定性。目前對M.tb的研究主要是運用M.tb的不同成分或者其自身分泌蛋白作為抗原,誘導不同的免疫細胞(γδT細胞、CD3+細胞等)發(fā)生反應,從而深入探究相關(guān)機制,以便于研制出新的疫苗或者抗TB藥物。M.tb的胞壁中的含有大量的脂類成分,它們就像一層厚厚的保護莢膜,既可以抵抗不利環(huán)境的侵害,也具有免疫調(diào)節(jié)作用,特別是在宿主固有免疫和適應性免疫應答的誘導中均扮演重要的角色,所以這提示M.tb的脂類成分可以成為重要的抗M.tb疫苗或者藥物研究的靶點。本實驗首先觀察,在體外培養(yǎng)結(jié)核桿菌裂解物刺激人外周血單個核細胞(PBMC)的實驗中,將胎牛血清(FBS)和人AB型血清作為培養(yǎng)液添加劑的效果比較。其次觀察,我們挑選的一些脂類抗原對人外周血中PBMC活化和增殖的作用,進而探討脂類抗原在結(jié)核感染中是否存在特異性免疫作用。方法:(1)抽取健康成人外周血,分別加入結(jié)核桿菌全菌裂解物(WCL)或者同時給予人重組白細胞介素-2(rh IL—2)和植物血凝素(PHA),同時設置空白對照組,之后分別在含10%人AB型血清的RPMI1640培養(yǎng)液和10%FBS的RPMIl640培養(yǎng)液中培養(yǎng)6天后,用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)結(jié)果,運用流式細胞儀(FCM)檢測淋巴細胞增殖情況。(2)運用FCM和酶聯(lián)免疫斑點實驗(ELISPOT)分別檢測,從PBMC中分里出來的粘附細胞被IL-4和GM-CSF誘導培養(yǎng)前后的表面抗原(CD11c,CD14,CD83)的表達,同時再檢測已經(jīng)被誘導培養(yǎng)成非成熟的樹突狀細胞(im DCs)且被下列抗原WCL,全脂質(zhì)(TLIP),丙酮可溶性脂質(zhì)(ASLIP),純硫脂(PSLIP),脂阿拉伯糖(LAM),LM,培養(yǎng)液分泌蛋白(CFP),結(jié)核桿菌耐熱抗原(M.tb-HAg),磷酸脂多糖(LPS)和空白對照組刺激培養(yǎng)后的細胞表面抗原(CD83)表達和IL-12分泌情況。(3)運用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)分別檢測,非粘附的PBMC(預先被CFSE標記過)加入到抗原已經(jīng)刺激過的im DCs后,共同培養(yǎng)3天后用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測各組培養(yǎng)上清液內(nèi)TNF-α的濃度。當培養(yǎng)到第9天,運用FCM檢測各組PBMC的T細胞亞群(CD3,CD4,CD8,NKT和γδT)增殖和分泌IL-4,TNF-α和IFN-γ的情況。結(jié)果:(1)添加人AB型血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,M.tb WCL對淋巴細胞增殖效果較同樣條件下添加FBS培養(yǎng)的增殖效果明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)用IL-4和GM-CSF誘導培養(yǎng)后的粘附細胞表面CD11c,CD14的比例相較于培養(yǎng)前的比例明顯下降,而表達CD1a的細胞比例則明顯上升,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)所有抗原在刺激im DCs后的成熟度標記CD83的比例相較于空白對照組均有明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)除了ASLIP組外,其它抗原在刺激im DCs后,其分泌的IL-12的細胞數(shù)量相較于空白對照組均明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(5)除了ASLIP和LM外,其它各抗原均能導致混合后的PBMC在培養(yǎng)3天后分泌TNF-α的濃度相較于空白對照組升高,而LM卻能導致PBMC分泌TNF-α的濃度相較于空白對照組降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(6)PBMC培養(yǎng)至9天后,各抗原均能促進CD8+T細胞和NKT細胞增殖,M.tb-HAg能促進γδT細胞增殖,相較于空白對照組差異有統(tǒng)計學意(P0.05)。(7)除了CFP和LM外,其它抗原均能促進增殖的CD8+T細胞分泌TNF-α,而LM卻能起到抑制作用,相較于空白對照組差異有統(tǒng)計學意(P0.05)。此外,除了WCL,TLIP和LM外,其它抗原均能促進增殖的γδT細胞分泌TNF-α,相較于空白對照組差異有統(tǒng)計學意(P0.05)。(8)所有抗原均能促進增殖的CD8+T和CD4+T細胞分泌IFN-γ,而其中的WCL,ASLIP,M.tb-HAg,LM和LPS還能促進增殖的γδT細胞分泌IFN-γ,相較于空白對照組差異有統(tǒng)計學意(P0.05)。(9)除了TLIP,PSLIP外,其它抗原均能促進未增殖的CD4+T細胞分泌IL-4,相較于空白對照組差異有統(tǒng)計學意(P0.05)。結(jié)論:(1)當以M.tb WCL為抗原的刺激人PBMC時,淋巴細胞在添加人AB型血清培養(yǎng)液中比在添加FBS的培養(yǎng)液中增殖效果更加明顯。(2)我們所選的各類脂類抗原均能激活PBMC的特異性免疫反應,具有潛在的抗TB藥物和疫苗組分可能性。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 T淋巴細胞亞群 脂類抗原 細胞因子 DCs 人AB型血清 胎牛血清
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R52
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照表7-10
• 中文摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 1 前言14-15
• 2 材料與方法15-24
• 2.1 實驗材料15-20
• 2.1.1 結(jié)核分枝桿菌抗原及其配制15-16
• 2.1.2 實驗標本的來源16
• 2.1.3 主要的試劑16-17
• 2.1.4 主要儀器和設備17-18
• 2.1.5 主要的試劑配制18-20
• 2.2 實驗方法20-24
• 2.2.1 人AB型血清分離20
• 2.2.2 人外周血（全血）PBMC分離20
• 2.2.3 人外周血白細胞濃縮液中PBMC分離20-21
• 2.2.4 PBMC的凍存與復蘇21
• 2.2.5 CFSE和PI染色方法21
• 2.2.6 兩種血清對結(jié)核桿菌抗原培養(yǎng)的比較21-22
• 2.2.7 單核細胞的分離和誘導培養(yǎng)22
• 2.2.8 粘附細胞的培養(yǎng)前后檢測以及ELISPOT檢測IL-12的分泌22-23
• 2.2.9 ELISA檢測培養(yǎng)中的Ｔ淋巴細胞TNF-a含量23
• 2.2.10 培養(yǎng)后細胞增殖情況及其增殖亞群檢測23-24
• 2.2.11 培養(yǎng)后細胞的細胞因子分泌情況的檢測24
• 2.3 統(tǒng)計學分析24
• 3 結(jié)果24-38
• 3.1 兩種血清對結(jié)核桿菌抗原刺激人外周血細胞增殖的比較24-27
• 3.2 粘附細胞分離和誘導成功的流式細胞儀結(jié)果27-29
• 3.3 imDCs被多種抗原刺激后流失細胞儀檢測成熟度29-30
• 3.4 多種抗原刺激imDCs后ELISPOT檢測結(jié)果30-31
• 3.5 PBMC培養(yǎng)中的ELISA檢測結(jié)果31-32
• 3.6 抗原刺激擴增培養(yǎng)后T細胞亞群增值情況32-34
• 3.7 抗原刺激擴增培養(yǎng)后T細胞分泌IFN-γ，IL-4，TNF-α 的檢測34-38
• 4 討論38-40
• 5 結(jié)論40
• 6 參考文獻40-43
• 附錄43-44
• 綜述44-51
• 參考文獻49-51

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 林蘭;鄭亞琳;李鳴鏑;黃達;;不同血清微環(huán)境培養(yǎng)的施萬細胞增殖狀況比較[J];醫(yī)學研究雜志;2013年08期

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核桿菌脂質(zhì)抗原對人外周血單個核細胞的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：350041