本文關(guān)鍵詞：大麻素對HPV感染引起的宮頸癌的作用機(jī)制及HBV慢性感染的小鼠模型的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的病毒(virus)由一個(gè)核酸分子(DNA或RNA)與蛋白質(zhì)(Protein)構(gòu)成或僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成。一般按遺傳物質(zhì)的不同可將病毒分為DNA病毒、RNA病毒和蛋白質(zhì)病毒,其中DNA病毒只能感染一種動(dòng)物(個(gè)別例外)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)病毒不但具有致病性,一些病毒也具有致癌性。目前的實(shí)驗(yàn)研究證明宮頸癌的發(fā)生與HPV感染有關(guān),肝癌的發(fā)生與HBV感染有關(guān)。宮頸癌已成為僅次于乳腺癌的常見婦女惡性腫瘤疾病。根據(jù)現(xiàn)有的的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),全球范圍內(nèi)的宮頸癌患者中每年的死亡人數(shù)將近20萬。每年有高達(dá)51萬的新發(fā)病例而中國每年的新發(fā)病例就超過10萬。與此同時(shí),中國現(xiàn)有乙肝病毒攜帶者超過1億,其中每年因罹患肝癌死亡的人數(shù)約有30萬。在慢性肝炎患者中,一部分患者肝臟會(huì)發(fā)生肝纖維化,并進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝癌。大麻素是從印度大麻(Cannabis indica)里發(fā)現(xiàn)的一組萜酚類化合物,存在于動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)。大麻素發(fā)生生物效應(yīng)的基礎(chǔ)是大麻素受體。研究發(fā)現(xiàn),大麻素對乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等具有抑制作用,在腫瘤組織中,增加大麻素受體在組織中的分泌可以選擇性抑制細(xì)胞的惡性增殖。另一些研究發(fā)現(xiàn)大麻素能夠影響HBV慢性感染的患者的肝組織病變進(jìn)程。本研究旨在構(gòu)建CB1/CB2基因真核表達(dá)載體,選取人腎胚細(xì)胞(HEK293)作為生物載體,研究大麻素的生物學(xué)特性；選取宮頸癌CaSki細(xì)胞系作為研究對象,研究大麻素對對宮頸癌凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制；利用HBVcccDNA建立慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型,研究大麻素對肝炎肝組織病變進(jìn)程的影響及機(jī)制。為闡明CB基因的生物活性及其對宮頸癌的影響和機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)為進(jìn)一步研究CB基因?qū)BV引起的肝損傷可能的作用提供了動(dòng)物模型。方法1.通過PCR擴(kuò)增獲取目的基因(cannabinoid receptor gene, CB基因)。2.通過雙酶切,載體連接,感受態(tài)轉(zhuǎn)化,質(zhì)粒提取等方法獲得CB基因真核表達(dá)載體,并通過雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。3.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將CB基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中,通過細(xì)胞免疫熒光聯(lián)合激光掃描共聚焦方法檢測CB基因的表達(dá)及細(xì)胞定位。4.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將CB基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入CaSki細(xì)胞中通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率。5.通過Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Bcl-2、Bax、Bad相關(guān)凋亡因子的表達(dá),研究CB基因?qū)m頸癌的作用機(jī)制。.6.通過PCR擴(kuò)增獲得HBV基因,經(jīng)酶切、純化后環(huán)化等生物方法制備HBVcccDNA。7.利用水動(dòng)力法尾靜脈注射HBVcccDNA至C57BL/6小鼠體內(nèi)。注射后,分別于第1d、3d、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10w經(jīng)小鼠尾靜脈采集血清樣本；于第1w、3w、6w、10w經(jīng)頸椎脫臼處死后取肝組織。8.利用放射免疫法檢測血清樣本中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的濃度變化；熒光定量PCR檢測血清和肝組織中HBV DNA拷貝數(shù)；免疫組織化學(xué)法檢測肝組織中HBsAg和IBcAg的表達(dá)；蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝組織病理變化。結(jié)果1.PCR產(chǎn)物電泳后分別得到rCB1 (1.5Kb)、CB1 (1.5Kb)、CB2 (1.1Kb)片段。2.雙酶切重組質(zhì)粒后電泳,pCDNA3.1(+)-CBl質(zhì)粒出現(xiàn)5.3 Kb和1.5 Kb兩條帶,GV230-CB1質(zhì)粒出現(xiàn)5.3 Kb和1.5 Kb兩條條帶,GV230-CB2質(zhì)粒出現(xiàn)5.3 Kb和1.1Kb兩條帶。3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后,細(xì)胞免疫熒光聯(lián)合激光掃描共聚焦發(fā)現(xiàn)CB蛋白表達(dá)于HEK293細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。4.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宮頸癌CaSki細(xì)胞,流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)CB轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率大于空白組的細(xì)胞凋亡率。5.WB和qRT-PCR檢測Bcl-2、bad、bax凋亡因子發(fā)現(xiàn)CB轉(zhuǎn)染組的bad、bax表達(dá)上調(diào),而Bcl-2呈下調(diào)。6.PCR獲得3.2KbHBV片段,BspQ I酶切、純化、T4DNA連接酶連接后獲得環(huán)化的]HBVcccDNA7.放射免疫法檢測不同時(shí)間點(diǎn)的血清樣本,發(fā)現(xiàn)HBsAg、HBeAg在小鼠血清中均有表達(dá)均呈現(xiàn)四個(gè)上升-下降曲線；熒光定量PCR結(jié)果顯示,隨著時(shí)間的推移,HBVDNA拷貝數(shù)呈下降趨勢；免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)HBsAg、HBcAg在肝組織中表達(dá)；HE染色病理分析發(fā)小鼠肝臟出現(xiàn)肝臟細(xì)胞炎癥、肝細(xì)胞纖維化、肝細(xì)胞壞死等病理變化。結(jié)論1.成功構(gòu)建了CB基因真核表達(dá)載體,并證明CB在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上的表達(dá)。2.CB能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡。3.CB能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制是通過抑制Bcl-2,上調(diào)bad、bax。4.成功建立了慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型。
【關(guān)鍵詞】：CB基因 HEK293細(xì)胞 CaSki細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 乙型肝炎病毒 HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA 小鼠模型
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.33;R512.62;R-332
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照7-10
• 中文摘要10-14
• 英文摘要14-19
• 前言19-25
• 參考文獻(xiàn)23-25
• 第一部分 CB1/CB2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建25-39
• 1 材料25-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、質(zhì)粒、細(xì)胞及菌株25
• 1.2 主要試劑25-26
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備26
• 1.4 主要試劑配制26-27
• 1.5 引物設(shè)計(jì)與合成27
• 2 方法27-32
• 2.1 組織總RNA的提取27-28
• 2.2 逆轉(zhuǎn)錄cDNA28
• 2.3 目的基因片段的PCR擴(kuò)增28-29
• 2.4 瓊脂糖凝膠電泳29
• 2.5 凝膠中DNA的回收29-30
• 2.6 目的基因與載體雙酶切30
• 2.7 載體連接30-31
• 2.8 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化31
• 2.9 陽性克隆菌的篩選和質(zhì)粒提取31-32
• 2.10 重組質(zhì)粒的鑒定32
• 2.11 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞32
• 3 結(jié)果32-37
• 3.1 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果32-34
• 3.2 載體鑒定34-36
• 3.3 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色聯(lián)合激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測36-37
• 4 討論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-39
• 第二部分：CB1/CB2對宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制39-50
• 1 材料39-41
• 1.1 主要試劑39
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備39-40
• 1.3 主要試劑配制40
• 1.4 引物設(shè)計(jì)與合成40-41
• 2 方法41-42
• 2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞41
• 2.2 CaSki細(xì)胞凋亡的檢測41
• 2.3 蛋白表達(dá)的Western blot檢測41-42
• 2.4 mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測42
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法42
• 3 結(jié)果42-47
• 3.1 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率42-43
• 3.2 Western blot法檢測目的蛋白、Bcl-2、Bax、Bad的蛋白表達(dá)43-45
• 3.3 熒光定量PCR檢測Bcl-2、Bax、Bad的mRNA表達(dá)45-47
• 4 討論47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 第三部分 HBV慢性感染的小鼠模型的建立50-63
• 1 材料與試劑50-51
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50
• 1.2 試劑與儀器50-51
• 2 方法51-52
• 2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)51
• 2.2 HBVcccDNA制備51
• 2.3 放射免疫法檢測血清樣本中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)濃度51-52
• 2.4 熒光定量PCR法檢測血清樣本和肝組織中HBV DNA拷貝數(shù)52
• 2.5 免疫組織化學(xué)法檢測肝組織中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎c抗原(HBcAg)的表達(dá)52
• 2.6 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝組織病理變化52
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法52
• 3 結(jié)果52-58
• 3.1 放射免疫檢測結(jié)果52-56
• 3.2 熒光定量PCR檢測結(jié)果56-57
• 3.3 免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果57
• 3.4 蘇木素-伊紅(HE)染色肝組織病理分析結(jié)果57-58
• 4 討論58-61
• 參考文獻(xiàn)61-63
• 全文總結(jié)63-64
• 文獻(xiàn)綜述64-75
• 參考文獻(xiàn)69-75
• 致謝75-76
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文76

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 崔澄;大麻素可以削弱恐懼性記憶[J];國外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊;2003年03期

2 趙艷;袁祖貽;;大麻素系統(tǒng)抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的研究進(jìn)展[J];心血管病學(xué)進(jìn)展;2010年03期

3 屠愛萍 ,王秉O;大麻素治療的前景[J];國外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊;2005年04期

4 張晶;劉建平;;大麻素類[J];中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào);2006年05期

5 陸永利;劉長金;李從德;;大麻素在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2008年02期

6 安永超;任維;楊唐斌;;大麻素Ⅰ型受體生理調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J];中國公共衛(wèi)生;2011年07期

7 楊潔;趙梓綱;趙華;李恒進(jìn);;大麻素抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;2009年03期

8 吳敏;任瑞寶;;大麻素類化合物抗腫瘤研究新進(jìn)展[J];腫瘤;2013年05期

9 ;生活[J];健康;2012年06期

10 ;信息[J];食品科學(xué);2007年06期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 胡博;陳紹洋;王強(qiáng);熊利澤;;內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)與神經(jīng)保護(hù)[A];中國針炙學(xué)會(huì)經(jīng)絡(luò)分會(huì)第十屆學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

2 馬雅萍;宋璐;劉振國;;大麻素CB1受體在成年大鼠腦分布的研究[A];第十一屆全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

3 李熳;蘇堂楓;趙一清;張令紅;彭妙;武彩;施靜;;電針通過激活大麻素2型受體下調(diào)炎癥皮膚組織促炎細(xì)胞因子表達(dá)[A];2011中國針灸學(xué)會(huì)年會(huì)論文集（摘要）[C];2011年

4 李艷娜;倪建波;李永渝;;大麻素類物質(zhì)對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠小腸肌電活動(dòng)變化的影響[A];中國病理生理學(xué)會(huì)受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)專業(yè)委員會(huì)暨消化專業(yè)委員會(huì)聯(lián)合學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 麥迪信;大麻素可抑制皮膚癌[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2003年

2 張稼 編譯;抑制過敏大麻樹皮乳劑新用途[N];大眾科技報(bào);2007年

3 陸志城;導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥 大麻素樣物質(zhì)是元兇？[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2005年

4 ;人體大麻素可能引發(fā)骨質(zhì)疏松[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2005年

5 記者 劉海英;英研究稱大麻素或可用于中風(fēng)治療[N];科技日報(bào);2013年

6 何屹;骨質(zhì)疏松與大麻素有關(guān)[N];科技日報(bào);2005年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 吳明春;尼古丁通過激活大麻素受體減輕Aβ1-42所致神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 蘇彥欣;大麻素AEA對學(xué)習(xí)記憶功能的影響及其作用機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2006年

3 王薇;大麻素對大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元上TRPV1受體的調(diào)制及其機(jī)制探討[D];華中科技大學(xué);2010年

4 谷新醫(yī);腺苷和大麻素在伏隔核引發(fā)去極化對抑制性突觸后電流的抑制作用的研究[D];吉林大學(xué);2004年

5 劉志強(qiáng);大麻素誘導(dǎo)的VTA DA神經(jīng)元的LTD[D];陜西師范大學(xué);2010年

6 韓爽;三氮唑酮、香豆素和喹啉二酮類大麻素Ⅱ型受體選擇性配體的設(shè)計(jì)、合成和活性評(píng)價(jià)[D];浙江大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張傳強(qiáng);大麻素受體激動(dòng)劑WIN55212-2對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞外向鉀電流的調(diào)控及其機(jī)制[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

2 嚴(yán)磊;大麻素對HPV感染引起的宮頸癌的作用機(jī)制及HBV慢性感染的小鼠模型的建立[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

3 周麗;大麻素對大鼠心肌細(xì)胞L型鈣電流的抑制作用[D];華中科技大學(xué);2006年

4 孟林偉;單次注射人工合成大麻素降低大鼠VTA多巴胺能神經(jīng)元興奮性[D];陜西師范大學(xué);2011年

5 吳永濤;大麻素CB1、CB2受體在腦組織中分布及其表達(dá)特性的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2009年

6 魏曉芳;LTD阻斷肽對于HU210在小鼠識(shí)別記憶影響上的作用[D];陜西師范大學(xué);2013年

7 朱麗;大麻素對大鼠腦出血神經(jīng)元的保護(hù)作用及其作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

8 蘇堂楓;電針通過激活大麻素2型受體下調(diào)炎癥皮膚組織促炎細(xì)胞因子表達(dá)[D];華中科技大學(xué);2010年

9 劉麗蓉;大麻素CB_2受體通路拮抗內(nèi)毒素休克的作用及機(jī)制[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

10 趙俊華;大麻素（WIN55，212-2）局部應(yīng)用對慢性青光眼視神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2008年

  本文關(guān)鍵詞：大麻素對HPV感染引起的宮頸癌的作用機(jī)制及HBV慢性感染的小鼠模型的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：336989