目的明確云南鼠疫自然疫源地野外小型獸類自然感染嗜吞噬細(xì)胞無形體狀況及多種因素對(duì)野外小型獸類感染嗜吞噬細(xì)胞無形體的影響,探討云南鼠疫自然疫源地嗜吞噬細(xì)胞無形體流行株基因多態(tài)性,為疾病防控提供科學(xué)依據(jù)。方法1.樣本來源本研究于云南鼠疫自然疫源地捕獲野外小型獸類2611只,對(duì)捕獲的野外小型獸類進(jìn)行肝、脾臟器樣本采集,共獲得2549份肝、脾臟器樣本,通過分層抽樣,1605份樣本作為本次實(shí)驗(yàn)檢測對(duì)象。2.DNA提取按照磁珠法微量細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書的操作步驟對(duì)野外小型獸類肝、脾臟器樣本進(jìn)行DNA提取,通過核酸濃度測定儀NanoDrop-1000對(duì)提取的樣本DNA進(jìn)行檢測,不符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本DNA重新進(jìn)行提取,對(duì)符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3.PCR擴(kuò)增采用巢式PCR進(jìn)行嗜吞噬細(xì)胞無形體16SrRNA基因片段擴(kuò)增,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行嗜吞噬細(xì)胞無形體gltA基因片段擴(kuò)增。4.基因序列測定和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析將測序成功的樣本基因序列片段通過登陸網(wǎng)站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）利用BLAST中的“Sequence Similarity Se... 

【文章來源】：大理大學(xué)云南省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

云南鼠疫自然疫源地采樣點(diǎn)分布圖

材料與方法4.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 結(jié)果判定將嗜吞噬細(xì)胞無形體質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行 10 倍濃度稀釋（100～106拷貝數(shù)/uL），通過 6 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)（每次實(shí)驗(yàn)各濃度設(shè)置 6 個(gè)平行孔），分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果并制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定拷貝數(shù)最低且穩(wěn)定的 Cq 值定為檢測閾值。本實(shí)驗(yàn)采用栗冬梅等[51]的測定結(jié)果，將檢測閾值定于 Cq＜35（100 拷貝數(shù)/uL）。當(dāng)被測樣本 Cq 值均數(shù)小于 35 且平行孔擴(kuò)增結(jié)果差異小，擴(kuò)增結(jié)果圖中陽性對(duì)照起峰而空白對(duì)照未起峰時(shí)（見圖 3），結(jié)果判定為疑似陽性，并送至測序公司進(jìn)行測序；為防止污染造成的假陽性結(jié)果，反應(yīng)體系配置，PCR 擴(kuò)增在不同區(qū)域進(jìn)行。

擴(kuò)增產(chǎn)物長度為 389bp；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)目的條帶的位置符合預(yù)計(jì)位置（見圖4 和圖 5）。注：Marker 分子量為 700bp，自上而下依次為 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp；M 為 DNAMarker ；PC 為陽性對(duì)照 ；NC 為陰性對(duì)照；YL-3-131 至 LH-4-165 號(hào)為陽性擴(kuò)增產(chǎn)物。圖 4 嗜吞噬細(xì)胞無形體巢式 PCR 第一輪擴(kuò)增結(jié)果注：Marker 分子量為 700bp，自上而下依次為 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp；M 為 DNAmarker ；PC 為陽性對(duì)照 ；NC 為陰性對(duì)照；YL-3-131 至 LH-4-165 號(hào)為陽性擴(kuò)增產(chǎn)物。圖 5 嗜吞噬細(xì)胞無形體巢式 PCR 第二輪擴(kuò)增結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]應(yīng)用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR法調(diào)查北京市部分城郊區(qū)鼠傳病原體流行狀況[J]. 栗冬梅,徐兆楠,朱彩英,張政,康央,張洪江,宋秀平,唐承軍,葛軍旗.  中國媒介生物學(xué)及控制雜志. 2019(01)
[2]中國人粒細(xì)胞無形體病流行現(xiàn)狀及其影響因素[J]. 張宏澤,尹家祥.  中國人獸共患病學(xué)報(bào). 2018(05)
[3]嗜吞噬細(xì)胞無形體病分子生物學(xué)診斷方法的研究進(jìn)展[J]. 李紅旺,劉士煌,吳保義,金春梅,于龍政.  吉林畜牧獸醫(yī). 2017(07)
[4]云南省玉龍鼠疫疫源地蚤類群落結(jié)構(gòu)與物種多樣性[J]. 湯麗,張長國,邵宗體,段興德,浦恩念,劉正祥,蘇超,宋志忠,高子厚.  中國媒介生物學(xué)及控制雜志. 2017(03)
[5]嗜吞噬細(xì)胞無形體在不同組織細(xì)胞間抗原差異研究[J]. 高娃,殷旭紅,郭生春,烏蘭圖雅,曹民治.  中國媒介生物學(xué)及控制雜志. 2017(03)
[6]北京東北部山區(qū)人群嗜吞噬細(xì)胞無形體血清流行病學(xué)調(diào)查[J]. 呂燕寧,竇相峰,陳麗娟,孫玉蘭,張秀春,關(guān)增智,黎新宇,王全意.  中國人獸共患病學(xué)報(bào). 2016(10)
[7]山東沂源硬蜱攜帶無形體的調(diào)查及進(jìn)化分析[J]. 劉相葉,武志強(qiáng),劉轉(zhuǎn)轉(zhuǎn),湯仁仙,顏超,鄭葵陽.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2015(12)
[8]云南省鼠疫自然疫源地研究現(xiàn)況[J]. 魏兆飛,尹家祥.  疾病預(yù)防控制通報(bào). 2015(06)
[9]嗜吞噬細(xì)胞無形體對(duì)宿主細(xì)胞影響研究進(jìn)展[J]. 張艷,寧長申.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2015(05)
[10]吉林省延邊地區(qū)自然生境內(nèi)蜱種類的調(diào)查[J]. 于龍政,海旭南,許應(yīng)天,崔明勛,梁晚?xiàng)?金春梅,張守發(fā).  國際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志. 2015 (01)

博士論文
[1]嗜吞噬細(xì)胞無形體及其復(fù)合感染的調(diào)查與實(shí)驗(yàn)研究[D]. 崔曉鳴.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 2016

碩士論文
[1]三株嗜吞噬細(xì)胞無形體AnkA蛋白原核表達(dá)及免疫原性差異性研究[D]. 姚娜.石河子大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3364138