本文關(guān)鍵詞：吡嗪酰胺耐藥相關(guān)基因pncA突變及相關(guān)蛋白活性檢測(cè)的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的分析pnc A基因不同突變位點(diǎn)對(duì)PZase活性的影響。方法收集142株耐多藥(Multi-drug resistant,MDR)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株,包括廣泛耐藥(Extensive drug resistant,XDR)菌株45株、前XDR(pre-XDR)菌株41株,以及普通MDR(細(xì)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)仍然敏感)菌株56株,應(yīng)用吡嗪酰胺(Pyrazinamide,PZA)耐藥試劑盒測(cè)定菌株對(duì)吡嗪酰胺的敏感性,并且對(duì)所有菌株進(jìn)行pnc A基因序列測(cè)定。挑選pnc A基因存在明顯極性改變的基因突變的PZA耐藥菌株5株和發(fā)生pnc A基因突變的PZA敏感菌株2株,對(duì)其pnc A基因進(jìn)行克隆表達(dá)并純化蛋白,測(cè)定其活性。本研究所有實(shí)驗(yàn)以結(jié)核分枝桿菌試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv作為對(duì)照,以BCG作為酶活性分析的陰性對(duì)照。結(jié)果142株臨床MDR菌株中,57.7%(82/142)株菌對(duì)PZA耐藥;其中XDR菌株耐藥比例為71.1%(32/45),pre-XDR菌株耐藥比例為63.4%(26/41)。XDR和pre-XDR菌株中PZA的耐藥率明顯高于對(duì)喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)仍然敏感的普通MDR菌株(42.9%,24/56)(c2=8.922,P=0.012);包括pnc A基因啟動(dòng)子區(qū)在內(nèi),PZA耐藥菌中共有85.4%(70/82)的菌株存在pnc A基因突變,而PZA敏感株中pnc A基因突變的率為10%(6/60);以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn),依靠pnc A基因突變?cè)\斷吡嗪酰胺耐藥的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為85.4%,91.7%,93.3%和82.1%�？寺”磉_(dá)獲得的9個(gè)蛋白中,野生型pnc A基因表達(dá)的蛋白活性為37.2μmol·min-1·mg-1;存在His51Pro和His51Gln突變的蛋白活性接近為0;另外有4株蛋白的(Ala146Thr、His57Asp、Thr76Pro和His71Tyr)蛋白活性與野生型相比降低較為明顯;發(fā)生78-84位核苷酸GCTGGC缺失的蛋白為不可溶蛋白。MIC檢測(cè)結(jié)果和酶活性分析表明,發(fā)生基因突變的PZA“敏感株”實(shí)際上為耐藥株。結(jié)論pnc A基因突變與吡嗪酰胺耐藥有很好的相關(guān)性,可用于吡嗪酰胺耐藥診斷,而表型藥敏結(jié)果存發(fā)生誤判的可能;pnc A基因突變導(dǎo)致PZase的蛋白活性降低或者喪失,對(duì)酶活性的影響取決于突變的位點(diǎn)和類(lèi)型。
【關(guān)鍵詞】：吡嗪酰胺酶 突變位點(diǎn) 酶活性 耐藥
【學(xué)位授予單位】：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R52
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一章 前言10-16
• 1.1 研究背景10
• 1.2 吡嗪酰胺理化性質(zhì)10-11
• 1.3 吡嗪酰胺作用機(jī)制11-12
• 1.4 吡嗪酰胺主要耐藥機(jī)制12
• 1.5 吡嗪酰胺酶研究進(jìn)展12-14
• 1.6 吡嗪酰胺酶活性測(cè)定14
• 1.7 吡嗪酰胺表型藥敏試驗(yàn)及影響因素14-15
• 1.8 研究目的及研究現(xiàn)狀15-16
• 第二章 材料和方法16-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-18
• 2.1.1 菌株來(lái)源16
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器16-17
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑17-18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法18-30
• 2.2.1 吡嗪酰胺表型藥敏實(shí)驗(yàn)18
• 2.2.2 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定18-19
• 2.2.3 pncA基因以及其啟動(dòng)子區(qū)測(cè)序19
• 2.2.4 載體及酶切位點(diǎn)選取19-20
• 2.2.5 重組蛋白目的基因的選擇20-21
• 2.2.6 TA克隆及藍(lán)白斑篩選21-23
• 2.2.7 PET30a-pnc A 的構(gòu)建23-25
• 2.2.8 PZase 的誘導(dǎo)和表達(dá)25
• 2.2.9 PZase的SDS-PAGE分析25-27
• 2.2.10 PZase的純化27
• 2.2.11 蛋白濃度測(cè)定（BCA 法）27-28
• 2.2.12 PZase活性測(cè)定28
• 2.2.13 PZase酶的性質(zhì)分析28-29
• 2.2.14 數(shù)據(jù)分析29-30
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-40
• 第四章 討論40-46
• 4.1 吡嗪酰胺耐藥率分析40-41
• 4.2 pncA基因在診斷吡嗪酰胺耐藥中的應(yīng)用價(jià)值41-43
• 4.3 pncA基因突變對(duì)PZase活性的影響43-46
• 參考文獻(xiàn)46-52
• 結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥研究進(jìn)展52-63
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況63-64
• 致謝64-65
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷65-66

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本文編號(hào)：334751