目的探索在HBV感染早期,激活肝內(nèi)TLR3/IFN信號通路對感染結(jié)局的影響及其可能的機(jī)制,為闡明少數(shù)成年人感染乙肝病毒后發(fā)展為慢性感染的原因提供可能的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。方法1.PAAV-HBV1.2質(zhì)粒與Poly（I:C）/生理鹽水（NS）一同以尾靜脈高壓水注射的方式導(dǎo)入8周齡,雄性,野生型BALB/C小鼠體內(nèi)。2.小鼠尾靜脈高壓水注射PAAV-HBV1.2質(zhì)粒10天后,再以尾靜脈高壓水注射的方式將Poly（I:C）/NS導(dǎo)入BALB/C小鼠體內(nèi)。3.按既定時(shí)間點(diǎn)采集血清樣本和肝脾組織樣本。4.用ELISA的方法檢測小鼠血清HBs Ag和HBe Ag的水平;用Real-Time PCR的方法檢測血清和肝組織中HBV的病毒滴度;用免疫組織化學(xué)的方法檢測肝細(xì)胞內(nèi)HBc Ag的表達(dá);5.分離肝內(nèi)浸潤淋巴細(xì)胞（LILs）,用ELISPOT的方法檢測特異性分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)。6.抽提肝組織的總RNA,Real-Time RT-PCR檢測CD3、CD4、CD8、IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-β、IFN-γ、ISG15、IP-10、PDL-1、IRF3、OAS、Perf、Fox P... 

【文章來源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：109 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

HBV感染早期注射Poly(I:C)阻礙HBV的清除PAAV-HBV1.2質(zhì)粒與Poly(I:C)/NS，一同以尾靜脈高壓水注射的方式導(dǎo)入8周齡，雄性，野生型BALB/C小鼠體內(nèi)

圖 3. HBV 感染早期注射 Poly(I:C)抑制 HBV 特異性 T 細(xì)胞應(yīng)答PAAV-HBV1.2 質(zhì)粒與 Poly(I:C) /NS，一同以尾靜脈高壓水注射的方式導(dǎo)入 8 周齡，雄性，野生型 BALB/C 小鼠體內(nèi)。注射第 15 天分離小鼠的肝內(nèi)浸潤淋巴細(xì)胞，在各反應(yīng)孔中加入 5×105個(gè)細(xì)胞，給予 rHBsAg、rHBcAg 和 CMV 刺激，不加刺激物的孔為陰性對照，加入 ConA 刺激物的孔作為陽性對照，ELISPOT 檢測淋巴細(xì)胞中 rHBsAg、rHBcAg 特異性分泌 IFN-γ的細(xì)胞數(shù)。（圖3.A）。注射后第 1 天和第 15 天，分離小鼠的 NPC 和脾細(xì)胞，用 CD4 和 CD8 流式抗體細(xì)胞分子表面染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測肝脾內(nèi) CD4+和 CD8+T 細(xì)胞的數(shù)量（圖 3.B）。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 2-3 次，每組至少 4 只小鼠。*表示有顯著性差異（p 值≤0.05），**表示有顯著性差異（p 值≤0.01）。3. HBV 感染早期注射 Poly(I:C)對肝內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響為了探索 HBV 感染早期 Poly(I:C)對肝內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響。以尾靜脈高壓水注射的方式將 PAAV-HBV1.2 質(zhì)粒及 Poly(I:C)/NS 導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，Real timeRT-PCR 檢測肝內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)水平。結(jié)果如圖 4 所示，Poly(I:C)處理組的肝組織IFN- 、IP10、OAS 和 ISG15 mRNA 的表達(dá)水平在注射后第 1 天上調(diào)，IL-10 mRNA

- 46 -圖 4. HBV 感染早期注射 Poly(I:C)對肝內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響PAAV-HBV1.2 質(zhì)粒與 Poly(I:C) /NS，一同以尾靜脈高壓水注射的方式導(dǎo)入 8 周齡，雄性，野生型 BALB/C 小鼠體內(nèi)。注射后第 1、4、10、20、30、40 和 60 天處死小鼠，取小鼠的肝組織并抽提 RNA。Real-time RT-PCR 定量檢測 CD3、CD4、CD8、 IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-β、IFN-γ、


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