目的應(yīng)用重組酶聚合酶擴增(RPA)技術(shù),建立一種敏感、特異、簡便且快速的日本血吸蟲核酸檢測方法。方法選擇Sj28S核糖體基因片段為靶序列,用Primer Premier 5軟件設(shè)計特異性引物,建立RPA擴增反應(yīng),并進(jìn)行優(yōu)化以確定最佳反應(yīng)條件。提取不同蟲期日本血吸蟲,以及曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲、單尾尾蚴感染釘螺、華支睪吸蟲、大片形吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲和牛帶絳蟲等基因組DNA,評價所建立方法的特異性和敏感性,并對不同混合比例(1∶10、 1∶50、 1∶100、 1∶250、 1∶500、 1∶1 000、 1∶2 000)的陽性和陰性釘螺基因組DNA的檢出性能和重復(fù)性進(jìn)行評價。結(jié)果建立的RPA方法可特異地擴增出日本血吸蟲216 bp大小的目的基因片段。RPA的最佳反應(yīng)條件為39℃、 20 min。該方法與曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲、單尾尾蚴感染釘螺、華支睪吸蟲、大片形吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲和牛帶絳蟲及陰性釘螺基因組DNA均無交叉反應(yīng)。針對日本血吸蟲成蟲基因組的最低檢出限為100 fg/μl,針對重組質(zhì)粒的最低檢出限為100拷貝/μl,且血吸蟲不同蟲期的基因組DNA樣本均能被準(zhǔn)確檢出。應(yīng)用建立的RP... 

【文章來源】：中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志. 2020年03期 北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

RPA檢測的特異性評價結(jié)果

RPA技術(shù)具有操作簡單、反應(yīng)迅速、靈敏高效的優(yōu)勢[20]，已被廣泛應(yīng)用于各種寄生蟲的檢測。研究人員分別應(yīng)用RPA技術(shù)對瘧原蟲、埃及血吸蟲和曼氏血吸蟲進(jìn)行檢測，均取得較好的實驗效果[21-23]。目前，關(guān)于日本血吸蟲感染的核酸檢測已有諸多報道，本課題組前期開展的日本血吸蟲核酸檢測技術(shù)Meta分析結(jié)果表明，等溫擴增技術(shù)的診斷效能優(yōu)于依賴變溫擴增設(shè)備的PCR類技術(shù)，在等溫擴增技術(shù)中，RPA又具有相對的診斷優(yōu)勢[24]。RPA技術(shù)是近年來新興起來的一種核酸等溫擴增技術(shù)，與傳統(tǒng)PCR相比，該方法無需高昂儀器設(shè)備，借助水浴鍋，甚至是在室溫下，20 min內(nèi)即可完成反應(yīng)，操作簡便快速，有利于基層單位和邊遠(yuǎn)山區(qū)的推廣應(yīng)用[25]。圖4 不同蟲期日本血吸蟲基因組DNA的RPA檢測結(jié)果

不同蟲期日本血吸蟲基因組DNA的RPA檢測結(jié)果


本文編號：2946577