目的丙戊酸(Valproic Acid,VPA)作為一種經(jīng)典的抗癲癇藥物被廣泛應用于臨床,它同時還具有抑制細胞凋亡、減輕炎性反應、保護及營養(yǎng)神經(jīng)元、減少膠質(zhì)細胞增生等神經(jīng)保護作用。腦型瘧(Cerebral Malaria,CM)是惡性瘧疾最嚴重的并發(fā)癥,是瘧疾患者死亡的主要原因,CM幸存患者有嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。近年來,抗瘧治療取得了一定成效,但仍面臨許多挑戰(zhàn),其中最重要的挑戰(zhàn)之一是瘧原蟲對抗瘧藥物的抗性增加,因此,尋找降低其死亡率,防止CM發(fā)生及減輕CM患者的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥等新的治療手段尤為重要。但VPA對腦型瘧的作用尚不清楚。因此,本課題旨在探討VPA對CM的神經(jīng)保護作用。方法1.腹腔注射1×10~4伯氏瘧原蟲感染的紅細胞到C57BL/6小鼠,建立實驗性小鼠腦型瘧模型,感染6天后,通過心臟取血后離心備用;2.體外培養(yǎng)C57BL/6胎鼠(E13.5天)神經(jīng)干細胞,3天半量換液,6天后進行傳代,培養(yǎng)第三代時,將其種植于多聚賴氨酸包被的24孔板中,3天后,加腦型瘧小鼠血清和正常小鼠血清處理神經(jīng)干細胞,同時加入1mM VPA,分化培基培養(yǎng)5天后,β-Ⅲ-tubulin與GFAP細胞免疫熒光染色、實時熒光定量PCR(β-Ⅲ-tubulin、GFAP)觀察神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞分化的影響;3.體外原代培養(yǎng)C57BL/6小鼠海馬神經(jīng)元,3天半量換液,7天后加腦型瘧小鼠血清和正常小鼠血清處理神經(jīng)元,同時加入1mM VPA,培養(yǎng)3天后,光鏡拍照,DCFH-DA檢測活性氧水平,CytoTox96?非放射性細胞毒性檢測試劑盒檢測乳酸脫氫酶(Lactic Dehydrogenase,LDH)釋放量,Tunel細胞凋亡檢測試劑盒檢測凋亡細胞,觀察VPA對加有腦型瘧小鼠血清的海馬神經(jīng)元的作用;4.腹腔注射1×10~4伯氏瘧原蟲感染的紅細胞到C57BL/6小鼠,建立實驗室小鼠腦型瘧模型,感染第2天起腹腔注射VPA 300mg/kg,連續(xù)注射5天;計算生存率、快速鼠昏迷和行為量表(Rapid Murine Coma and Behavior Scale,RMCBS)進行評分;蘇木素-伊紅染色觀察感染紅細胞滯留及出血情況;取腦組織進行伊文斯藍染色,比較血腦屏障的破壞程度;取腦組織提取RNA,比較IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的水平;5.腹腔注射1×10~4伯氏瘧原蟲感染的紅細胞到C57BL/6小鼠,建立實驗室小鼠腦型瘧模型,感染第2天起腹腔注射VPA 300mg/kg,連續(xù)注射5天;取腦組織提取RNA,比較腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial cell line-DerivedNeurotrophic Factor,GDNF)、神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)等水平,并立即取腦組織進行膜片鉗實驗,觀察VPA對海馬區(qū)神經(jīng)元膜電位的影響。結果1.成功體外提取培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)干細胞,細胞免疫熒光染色結果顯示加腦型瘧小鼠血清后β-Ⅲ-tubulin陽性比例降低,同時加入VPA后β-Ⅲ-tubulin陽性比例升高;加腦型瘧小鼠血清后GFAP陽性比例升高,同時加入VPA后GFAP陽性比例降低。熒光實時定量PCR與免疫熒光染色抑制,顯示加腦型瘧小鼠血清后β-Ⅲ-tubulin含量降低,同時加入VPA后β-Ⅲ-tubulin含量升高;加腦型瘧小鼠血清后GFAP含量升高,同時加入VPA后GFAP含量降低;2.成功體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,結合光鏡結果、活性氧含量、LDH釋放率及Tunel染色結果可觀察到:加入腦型瘧小鼠血清后,光鏡下海馬神經(jīng)元漂浮細胞增加,活性氧含量增加,LDH釋放增加,Tunel凋亡細胞增加,而同時加入VPA后,海馬神經(jīng)元漂浮細胞降低,活性氧含量減少,LDH釋放減少,Tunel凋亡細胞減少;3.成功建立實驗性腦型瘧模型,腹腔注射VPA后小鼠生存時間延長,快速鼠昏迷和行為學評分降低,同時HE染色顯示VPA治療后感染紅細胞滯留及出血減少;伊文斯藍染色結果顯示VPA治療后小鼠血腦屏障破壞減輕;腦組織中IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-α量均下調(diào),IL-10量上調(diào);4.成功建立實驗性腦型瘧模型,腹腔注射VPA后,腦組織中BDNF、GDNF量上調(diào),NGF量無變化,膜片鉗實驗結果顯示VPA處理后小鼠海馬神經(jīng)元突觸后膜電位得到提高。結論1.通過免疫熒光染色及熒光實時定量可觀察到:腦型瘧小鼠血清抑制胎鼠來源神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化,而VPA能在一定程度上挽救其抑制作用,使神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化的比例升高;腦型瘧小鼠血清促進其向星形膠質(zhì)細胞分化,而VPA能在一定程度上使神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞分化的比例降低;2.腦型瘧小鼠血清引起胎鼠來源神經(jīng)元凋亡,而VPA能在一定程度上保護腦型瘧小鼠血清引起的神經(jīng)元凋亡;3.VPA腹腔注射能提高實驗性腦型瘧小鼠生存率,改善神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,減輕腦部炎癥及感染紅細胞滯留的情況,并減輕血腦屏障的破壞;4.VPA腹腔注射能提高實驗性腦型瘧能提高小鼠海馬神經(jīng)元突觸后膜電位,對腦型瘧小鼠發(fā)揮一定的神經(jīng)保護作用。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R531.3
【部分圖文】：

圖1分離孕13.5天胎鼠大腦組織過程

神經(jīng)干細胞的鑒定

海馬神經(jīng)元的鑒定
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2 李海云,何建國,江靜波;腦型瘧及其靈長類模型[J];寄生蟲與醫(yī)學昆蟲學報;1996年04期

3 楊紅霞,張萬發(fā),李俊;腦型瘧1例誤診分析[J];西南國防醫(yī)藥;1997年06期

4 吳莉菊;邵葆若;;腦型瘧發(fā)病機制研究進展[J];國外醫(yī)學(寄生蟲病分冊);1991年03期

5 張恩英;;急性無并發(fā)癥瘧疾病人和腦型瘧病人的抗子孢子抗體[J];國外醫(yī)學(寄生蟲病分冊);1987年01期

6 王鳴杰;;贊比亞成人腦型瘧的臨床表現(xiàn)和治療效果的初步報告[J];國外醫(yī)學(寄生蟲病分冊);1988年01期

7 莊兆農(nóng);腦型瘧病人體內(nèi)奎寧藥物動力學——二室模型預測快速靜注后的血漿濃度[J];國外醫(yī)學(寄生蟲病分冊);1989年06期

8 苗興旺;;單劑苯巴比妥對腦型瘧中驚厥的預防作用[J];國外醫(yī)藥.合成藥.生化藥.制劑分冊;1989年05期

9 吳惠敏;;奎寧用于腦型瘧的治療[J];國外醫(yī)學(寄生蟲病分冊);1984年02期

10 邊中啟,王功焯,田學明,范江;腦型瘧患者紅細胞膜蛋白分子的表達(英文)[J];中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志;1999年06期

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本文編號：2881921