研究背景:自噬作為一種細(xì)胞免疫防御機(jī)制受到廣泛關(guān)注和研究。自噬與針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān),其可通過(guò)參與調(diào)控溶酶體與吞噬體的融合,以及吞噬溶酶體的成熟過(guò)程,影響巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的殺傷。有研究表明轉(zhuǎn)錄因子NRF2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)通過(guò)調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生,參與巨噬細(xì)胞對(duì)感染結(jié)核分枝桿菌的殺傷。本研究旨在進(jìn)一步探討轉(zhuǎn)錄因子NRF2在巨噬細(xì)胞感染結(jié)核分枝桿菌自噬中的作用及其機(jī)制。方法:(1)通過(guò)RNA-seq技術(shù)對(duì)結(jié)核病人和健康人外周血中PBMC的線性RNA測(cè)序來(lái)檢測(cè)NRF2的基因表達(dá)。然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitive PCR,q-PCR)技術(shù)對(duì)結(jié)核病人和健康人的外周血中PBMC的NRF2的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。(2)建立由PMA(phorbol ester,佛波醇)誘導(dǎo)的M.tb感染THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞THP-1(a)模型。通過(guò)流式細(xì)胞分析儀和熒光顯微鏡檢測(cè)活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS)的變化水平;(3)利用q-PCR技術(shù),檢測(cè)M.tb感染巨噬細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)的NRF2和抗氧化物SOD-1、SOD-4、PPARA、NOX-1的基因轉(zhuǎn)錄水平;(3)利用蛋白質(zhì)印跡(Western Blot,WB)檢測(cè)M.tb感染巨噬細(xì)胞2h,4h,6h,12h和24h后NRF2和自噬相關(guān)蛋白(Beclin-1,Atg-12,Atg-7,Atg-5,Atg-3,LC-3)的表達(dá)水平。(4)再利用WB檢測(cè)M.tb感染Brusatol預(yù)處理THP-1(a)后的NRF2和自噬相關(guān)蛋白(Beclin-1,Atg-12,Atg-7,Atg-5,Atg-3,LC-3)的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)RNA-seq測(cè)序結(jié)果顯示:與健康對(duì)照組相比,隱性結(jié)核病患者(LTB)NRF2線性RNA表達(dá)水平顯著降低(p0.01),活動(dòng)性結(jié)核病患者(TB)輕度增高;q-PCR的結(jié)果表明,結(jié)核病人NRF2表達(dá)水平相對(duì)于健康人也呈現(xiàn)輕度增高趨勢(shì);(2)M.tb感染巨噬細(xì)胞組與未感染組相比較ROS產(chǎn)生水平水平顯著升高(p0.01);(3)M.tb感染THP-1(a)后,相對(duì)于THP-1(a)對(duì)照組,感染組細(xì)胞NRF2,SOD-4,SOD-1以及PPARA基因在轉(zhuǎn)錄水平都出現(xiàn)了不同程度的增高,其中SOD-4,SOD-1,PPARA表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05或P0.01,n=3);(4)M.tb感染THP-1(a)6h前后,NRF2以及自噬相關(guān)蛋白(BECLIN-1,Atg-12,Atg-7,Atg-5,Atg-3,LC3)表達(dá)水平達(dá)到峰值;(5)Brusatol阻斷NRF2活化后,M.tb感染THP-1(a)組的自噬相關(guān)蛋白(Beclin-1,Atg-12,Atg-7,Atg-5,Atg-3,LC3)的蛋白表達(dá)水平顯著降低。結(jié)論:1.結(jié)核分枝桿菌感染對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NRF2表達(dá)水平和活性有重要影響;2.NRF2通過(guò)調(diào)控胞內(nèi)ROS水平影響巨噬細(xì)胞對(duì)感染結(jié)核分枝桿菌的自噬。
【學(xué)位單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R52
【部分圖文】：

24 例、隱性結(jié)核病患者 13 例和健康對(duì)照 31 例，著性差異（p<0.01）（表 1）。表 1 RNA-seq 測(cè)序樣本年齡比較組 別年齡( )組（31） 41±12B （13） 20±1組（24） 29±9分析結(jié)核病患者、隱性結(jié)核病患者和健康對(duì)照組表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與健康對(duì)照組相比，隱性結(jié)核 表達(dá)水平顯著降低（p<0.01），活動(dòng)性結(jié)核病患差異（p>0.01）（圖 1）。x ±s

病人升高顯著（p<0.01,n=4），但在年輕組初治結(jié)核病人4），如圖 2：表 1：結(jié)核病人和健康對(duì)照標(biāo)本信息表本號(hào) 年齡（y） 性別h-7 9 男h-14 58 男h-18 64 男h-19 26 男C-1 29 男C-1 49 男C-3 67 男C-4 49 女

3.4 M.tb 感染巨噬細(xì)胞 ROS 水平檢測(cè)結(jié)果圖 A-F 分別為 THP-1（a）對(duì)照組，M.tb 感染 THP-1（a）細(xì)胞 30min，2h，4h，6h，10h 組的巨噬細(xì)胞內(nèi) ROS 的變化水平（圖 4A~F）；圖 4 G 為各組平均熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)圖，我們可以發(fā)現(xiàn)，M.tb 感染巨噬細(xì)胞 30min 后就出現(xiàn)了 ROS 的激活，而隨后的 2h，4h，6h，10h 的 M.tb 的感染一直使巨噬細(xì)胞處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)。
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本文編號(hào)：2870391