目的:通過分析HBV相關(guān)HCC患者的癌及癌旁組織中HBX突變特征,同時(shí)檢測自噬相關(guān)蛋白(Beclin-1、LC3B和P62)表達(dá)情況評定HCC組織中自噬活性,并在以上基礎(chǔ)上探索HBX突變致HCC的過程中是否與自噬有關(guān),以期為HBX致肝癌作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:以HBV相關(guān)的HCC患者為研究對象,收集2015年7月1日~2016年12月30日廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科因HCC手術(shù)切除的HCC患者,取其HCC組織及對應(yīng)癌旁組織(取自距手術(shù)切緣大于2cm),同時(shí)收集患者臨床資料。采用巢式PCR方法擴(kuò)增HBX基因序列,對純化后產(chǎn)物應(yīng)用Sanger測序法測定肝癌與癌旁組織中HBX突變類型;免疫組織化學(xué)法檢測肝癌及癌旁組織中自噬相關(guān)蛋白(Beclin-1、LC3B及P62)的表達(dá)情況;運(yùn)用SPSS22.0軟件包分析數(shù)據(jù)。對所有定量數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),配對t檢驗(yàn)分析癌與癌旁組織間蛋白均值差異;自噬蛋白表達(dá)與臨床病理因素間關(guān)系采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較用單因素方差分析,組內(nèi)兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料率與構(gòu)成比的比較用χ~2檢驗(yàn);Pearson相關(guān)分析自噬蛋白表達(dá)的相關(guān)性;Sperman相關(guān)分析HBX突變與自噬蛋白表達(dá)間的相關(guān)關(guān)系;P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(雙側(cè))。結(jié)果:1.HBX基因羧基端序列缺失情況癌組織中,HBX羧基端序列缺失率為25.0%(15/60),高于癌旁組織6.7%(4/60),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ~2=7.566,P=0.006);癌組織HBX羧基端序列缺失長度范圍為(6~31)bp,癌旁組織羧基端缺失長度范圍為(9~25)bp。2.HBX基因插入突變情況插入突變存在于肝癌組織的6條序列和癌旁組織的3條序列中,分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但特殊的是插入突變序列中均存在AFP20ng/ml,另外發(fā)生插入突變序列中有89%序列的位于HBX羧基端;3.HBX基因點(diǎn)突變情況本研究發(fā)現(xiàn)的熱點(diǎn)氨基酸點(diǎn)突變,癌與癌旁組織中均存在,并非某一組織所特有;非差異性熱點(diǎn)突變中,S78R、P152T突變檢出率均在90%左右,是所有突變中檢出率較高的熱點(diǎn)突變;癌組織第47、118、130、131、130+131、132、143、30+144位氨基酸點(diǎn)突變率分別為53.6%、32.1%、78.6%、78.6%、76.8%、30.4%、28.6%、12.5%,高于癌旁組織的33.9%、14.3%、58.9%、58.9%、55.4%、10.7%、12.5%、1.8%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05),其余熱點(diǎn)突變在癌與癌旁組織中間的檢出率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);4.差異性點(diǎn)突變對蛋白結(jié)構(gòu)影響分析本研究提示的6個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的突變位點(diǎn)均位于HBX羧基端且其中5個(gè)位于EnhII(K118T)或BCP(K130M、V131I、F132Y/E、C143R/H)區(qū)域;A47T位于重要的T_B細(xì)胞表位;K118T、K130M、V131I、F132Y/E位于重要的T_H細(xì)胞表位(aa111-135);K130M、V131I、F132Y/E突變位點(diǎn)T_C細(xì)胞表位(aa126-134)之中;5.Beclin-1、LC3B及P62蛋白在癌與癌旁組織中的表達(dá)情況Beclin-1、LC3B及P62蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,為黃色、棕黃色染色顆粒,彌漫分布。與癌旁組織相比,癌組織Beclin-1、LC3B蛋白表達(dá)量降低,而P62蛋白表達(dá)量增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);6.Beclin-1、LC3B及P62蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Beclin-1蛋白表達(dá)水平與腫瘤大小有關(guān)聯(lián)(F=3.474,P=0.030);LC3B蛋白表達(dá)水平與BCLC分期(A/B)有關(guān)聯(lián)(t=5.960,P0.0001);P62蛋白表達(dá)水平與Edmondson分級,癌栓存在情況有關(guān)聯(lián)(F=4.274,t=2.459,P均0.05);與其它臨床病理特征差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7.HBX突變與Beclin-1、LC3B及P62蛋白的相關(guān)性分析根據(jù)上述檢測HBX突變體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,同時(shí)結(jié)合前期本課題組血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其他課題組研究成果,篩選出幾個(gè)不同的HBX基因突變體,分別是羧基端缺失情況、V30L、A47T、V88N/D、K118T、K130M、V131I、F132Y/E、C143R/H、S144Y、V30L+S144Y、K130M+V131I、三聯(lián)突變K130M+V131I+F132Y/E、三聯(lián)突變K130M+V131I+C143R/H;相關(guān)分析結(jié)果顯示:癌組織中,F132Y/E、V30L+S144Y雙突變、K130M+V131I+F132Y/E三聯(lián)突變與LC3B呈現(xiàn)正相關(guān)(r_s=0.278、0.279、0.278,P均0.05);而在癌旁組織中,A47T與LC3B呈正相關(guān)(r_s=0.270.270,P=0.045);K118T氨基酸位點(diǎn)突變與Beclin-1蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),分別是(r_s=-0.325,P=0.014),其余HBX突變未見與Beclin-1、LC3B及P62蛋白表達(dá)有相關(guān)性(P0.05)。8.Beclin-1、LC3B及P62蛋白在癌與癌旁組織中表達(dá)的相關(guān)性分析癌旁組織中,Beclin-1和LC3B的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.416,P=0.001);Beclin-1和P62的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.361,P=0.006);LC3B和P62的表達(dá)無明顯相關(guān)性(P0.05)。癌組織中,Beclin-1、LC3B及P62的間均無明顯相關(guān)性(P0.05)。結(jié)論:1.HBX突變具有多態(tài)性;2.盡管HBX序列中點(diǎn)突變數(shù)量眾多,但僅有部分點(diǎn)突變對HCC發(fā)生有影響;3.自噬活性降低可能與HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān);4.HBX F132Y/E、V30L+S144Y雙突變、K130M+V131I+F132Y/E三聯(lián)突變可能與自噬延長過程有影響,這可能與HCC的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程有關(guān)。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R735.7;R512.62
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
1.材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 研究對象
        1.1.2 研究標(biāo)本處理
    1.2 倫理學(xué)說明
    1.3 本課題技術(shù)路線圖
    1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
        1.4.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        1.4.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑
    1.5 實(shí)驗(yàn)方法
        1.5.1 組織中HBV DNA的提取：實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)說明書進(jìn)行
        1.5.2 組織HBV DNA純度測定
        1.5.3 巢式PCR擴(kuò)增HBX基因
        1.5.4 瓊脂糖凝膠電泳
        1.5.5 巢式PCR產(chǎn)物測序與結(jié)果分析
        1.5.6 石蠟包埋切片
        1.5.7 免疫組織化學(xué)法操作步驟
        1.5.8 免疫組化結(jié)果判定
    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2.結(jié)果
    2.1 研究對象的臨床特征
    2.2 HBX基因擴(kuò)增分析
    2.3 HBX基因測序峰圖
    2.4 HBX基因突變分析
        2.4.1 HBX序列多重對比情況
        2.4.2 HBX基因羧基端序列缺失情況
        2.4.3 HBX基因插入突變情況
        2.4.4 HBX基因點(diǎn)突變情況
        2.4.5 差異性點(diǎn)突變對蛋白結(jié)構(gòu)的影響分析
    2.5 Beclin-1、LC3B及P62蛋白在癌與癌旁組織中的表達(dá)情況
    2.6 Beclin-1、LC3B和P62蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系
    2.7 HBX突變與Beclin-1、LC3B及P62蛋白的相關(guān)性分析
    2.8 Beclin-1、LC3B及P62蛋白在癌與癌旁組織中表達(dá)的相關(guān)性分析
3.討論
全文小結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄1 中英文縮略詞一覽表
綜述 乙型肝炎病毒X蛋白與自噬在肝癌發(fā)生發(fā)展中作用 的研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文

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本文編號：2862908