研究背景和目的:干擾素α是目前廣泛用于臨床的一線抗乙肝病毒藥物,它具有廣譜性、高活性、間接性及種屬特異性等特點(diǎn)的抗病毒效應(yīng)。它是一種具有抗病毒作用的細(xì)胞因子,干擾素自身不能直接使病毒滅活,而往往是通過(guò)激活JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮其抗病毒效應(yīng)。研究表明,I型干擾素(IFN-α、IFN-β)通過(guò)與其特異性的干擾素受體(IFNAR)結(jié)合后,激活JAK激酶-JAK1、Tyk2,繼而招募有SH2結(jié)構(gòu)域的STAT1和STAT2(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子),并使之磷酸化,激活的STAT1、2異源性二聚體與IRF-9(IFN調(diào)節(jié)因子9)結(jié)合,再結(jié)合上ISGF3γ組成ISGF3(IFN刺激基因因子3復(fù)合體),ISGF3從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核與干擾素刺激應(yīng)答元件(ISRE)結(jié)合,啟動(dòng)后者轉(zhuǎn)錄,激活蛋白激酶(PKR)等一系列調(diào)控抗病毒靶基因的轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)多種抗病毒蛋白的表達(dá),最主要的抗病毒蛋白有PKR與核糖核酸酶L(RNase L),它們分別通過(guò)影響病毒mRNA的翻譯與降解RNA起抗病毒作用。干擾素α同時(shí)還具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用。持續(xù)性的乙型肝炎病毒感染是引起原發(fā)性肝癌的主要原因。在HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中乙肝病毒X蛋白(HBx)起十分關(guān)鍵的作用,它可以作為原癌基因或者共同作用因子促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。本研究目的是建立HBV相關(guān)的肝癌細(xì)胞模型,即轉(zhuǎn)染攜帶HBx基因慢病毒的人肝癌細(xì)胞Huh-7細(xì)胞,觀察干擾素α對(duì)該細(xì)胞模型細(xì)胞行為學(xué)和JAK-STAT信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的影響,從肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為角度及干擾素α主要作用的JAK-STAT信號(hào)通路上重要分子(IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR、RNAse L)的表達(dá)水平來(lái)分析探討干擾素α抑制HBV相關(guān)HCC的機(jī)制。同時(shí)設(shè)計(jì)使用干擾素α抗病毒治療的慢性乙肝患者臨床試驗(yàn),檢測(cè)各治療節(jié)點(diǎn)有效組及無(wú)效組患者之間上述5個(gè)分子表達(dá)水平差異,以期尋找能早期判斷干擾素α應(yīng)答效果的因子。方法:1、構(gòu)建攜帶乙肝病毒X基因的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞Huh-7,采用免疫熒光進(jìn)行鑒定;再以MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力;之后將Huh-7和Huh-7-HBV X再加入干擾素α干預(yù),觀察干擾素α對(duì)上述細(xì)胞模型生物學(xué)行為的影響。2、同樣選擇肝癌細(xì)胞Huh-7為對(duì)照,轉(zhuǎn)染攜帶HBV X基因的慢病毒載體形成Huh-7-HBx,之后將Huh-7和Huh-7-HBV X再加入干擾素α干預(yù);自干擾素作用環(huán)節(jié)的始動(dòng)環(huán)節(jié)起分別用RT-qPCR和Western-blot檢測(cè)JAK-STAT通路重要相關(guān)分子即干擾素受體(IFNAR1、IFNAR2)干擾素刺激基因因子3(ISGF3)、RNA依賴(lài)蛋白激酶(PKR)、核糖核酸酶(RNase L)的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。3、收集在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科就診的符合干擾素α治療指征的慢性乙型肝炎患者,入組患者給予聚乙二醇IFNα-2b,1.0μg/kg/周,每周1次,皮下注射,或普通IFN-α,500萬(wàn)U,隔日一次,皮下注射。療程48周,治療24周仍無(wú)應(yīng)答者作無(wú)效病例停藥。收集基線(治療前)、治療4周、8周、12周、24周時(shí)的PBMCs。所有患者在治療24周療程結(jié)束時(shí)判斷療效,依據(jù)療效分為兩組:(1)有效組:ALT正常,HBV-DNA500IU/m L或下降幅度≥2log IU/m L,HBeAg發(fā)生或未發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換;(2)無(wú)效組:ALT正�；蛏�,HBV-DNA下降幅度2log IU/mL,HBe Ag未發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換。分別采用RT-qPCR法和Western blot法檢測(cè)各治療時(shí)間點(diǎn)PBMCs中JAK-STAT通路各分子IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR、RNase-L的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1、Huh-7細(xì)胞經(jīng)HBX修飾后遷移和侵襲能力部分增強(qiáng),而經(jīng)IFN-α干預(yù)后Huh-7細(xì)胞和Huh-7轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移和侵襲能力均有所減弱,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Huh-7經(jīng)HBX修飾后增殖能力無(wú)明顯影響,同時(shí)經(jīng)IFN-α干預(yù)后Huh-7和Huh-7轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力亦無(wú)明顯影響(P0.5)。2、經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后Huh-7細(xì)胞中HBX基因顯著高于轉(zhuǎn)染前(P0.05)。經(jīng)IFN-α干預(yù)后Huh-7細(xì)胞IFNAR2、ISGF3、PKR、RNaseL基因表達(dá)均出現(xiàn)了上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而經(jīng)IFN-α干擾后Huh-7-HBx轉(zhuǎn)染組細(xì)胞IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR、RNase L基因表達(dá)亦均出現(xiàn)了上調(diào),且上調(diào)水平高于Huh-7細(xì)胞組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后Huh-7細(xì)胞HBX蛋白顯著高于轉(zhuǎn)染前(P0.05)。經(jīng)干擾素α干預(yù)后Huh-7細(xì)胞和Huh-7-HBx細(xì)胞上述5個(gè)分子的蛋白表達(dá)水平變化呈現(xiàn)與mRNA表達(dá)水平基本一致的結(jié)果,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、共入選41例患者,包括30名男性及11名女性,18例患者接受PegIFNα-2b,1.5μg/Kg,每周1次;23名患者接受普通IFNα-2b,500萬(wàn)單位,每周3次,所有患者完成24周治療。24周治療結(jié)束,依據(jù)上述分組標(biāo)準(zhǔn),在41名患者中25名患者為治療有效組(A組),16名為治療無(wú)效組(B組)。治療基線、4周、8周、12周和24周時(shí),IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR和RNASE-L的mRNA表達(dá)水平組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且均為A組B組。治療4周時(shí),IFNAR2及PKR的mRNA水平治療有效組顯著高于無(wú)效組,在治療8周時(shí)IFNR1及ISGF3的水平有效組顯著高于無(wú)效組,而Western-blot檢測(cè)顯示的上述蛋白水平也呈現(xiàn)基本一致的結(jié)果。結(jié)論:1.HBx可增加肝癌細(xì)胞Huh-7的體外遷移和侵襲能力,但對(duì)增殖能力無(wú)明顯影響;IFNα可抑制肝癌細(xì)胞Huh-7和Huh-7-HBx轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移和侵襲能力,但對(duì)增殖能力亦無(wú)明顯影響。2.干擾素α可上調(diào)肝癌細(xì)胞Huh-7中JAK-STAT通路分子IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR、RNase L基因以及蛋白的表達(dá)水平,而干擾素α干預(yù)后Huh-7-HBx轉(zhuǎn)染組細(xì)胞IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR、RNaseL基因和蛋白表達(dá)亦均出現(xiàn)了上調(diào),且上調(diào)水平高于Huh-7細(xì)胞組。提示干擾素α抗HBV相關(guān)性肝癌可能與其上調(diào)上述抗病毒蛋白有關(guān)。3.JAK-STAT通路分子IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR和RNAse-L為干擾素α抗病毒作用的重要分子,上述5個(gè)分子的mRNA以及蛋白的組間和時(shí)間點(diǎn)差異性表達(dá)可能是影響IFNα抗病毒效應(yīng)的重要機(jī)制。從早期預(yù)測(cè)干擾素α治療慢性乙肝應(yīng)答價(jià)值的角度來(lái)看,IFNAR2及PKR有望成為早期預(yù)測(cè)干擾素應(yīng)答的指標(biāo)。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R512.62
【部分圖文】：

攜帶乙肝病毒X基因慢病毒載體陽(yáng)性克隆鑒定

Huh-7肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒白光照片

Huh-7肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒綠色熒光照片
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2858556