發(fā)布時(shí)間：2020-10-23 22:19

　　 背景慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染為免疫介導(dǎo)性疾病,宿主的天然免疫和獲得性免疫功能對HBV清除和疾病轉(zhuǎn)歸有著重要影響,其中乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)血清學(xué)轉(zhuǎn)換為慢性HBV感染者自然史或抗病毒治療過程中的重要節(jié)點(diǎn)。研究表明慢性乙型肝炎(CHB)患者經(jīng)抗病毒治療后出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,可減少改善肝臟疾病進(jìn)展,延緩和阻止肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生,在臨床實(shí)踐中作為持久療效和停藥的指標(biāo)之一。肝臟作為天然免疫優(yōu)勢器官,研究發(fā)現(xiàn)肝組織中包含有大量的各種天然免疫細(xì)胞,其中以自然殺傷(NK)細(xì)胞最為重要。NK細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子如干擾素-γ (IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α (TNF-α)介導(dǎo)抗病毒效應(yīng),同時(shí)其也是啟動(dòng)和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的核心細(xì)胞之一。既往研究表明獲得性免疫激活,特別是特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答對控制HBV感染具有重要作用,其主要通過分泌IFN-y和TNF-a以非溶細(xì)胞性機(jī)制降解病毒RNA、核殼體以及病毒DNA復(fù)制的中間產(chǎn)物,控制病毒的復(fù)制。宿主體內(nèi)針對HBV的免疫應(yīng)答不僅影響感染后自然結(jié)局,也影響著CHB患者抗病毒治療的療效,尤其和HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換密切相關(guān)。效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮作用離不開輔助性細(xì)胞的參與。CD4+T細(xì)胞在輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和維持有效的CTL應(yīng)答方面起著非常重要的作用。如上所述,HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換是機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的過程,由于HBeAg為T細(xì)胞依賴性抗原,B細(xì)胞產(chǎn)生HBeAb必須有輔助性CD4+T細(xì)胞的參與。雖然既往研究提示幼稚CD8+T細(xì)胞在協(xié)同信號(hào)刺激下增殖分化成為效應(yīng)性細(xì)胞的過程并不依賴于CD4+T細(xì)胞輔助,但是,當(dāng)機(jī)體再次接觸病原體感染時(shí),長壽命的功能性記憶性CD8+T細(xì)胞的產(chǎn)生、維持以及再次免疫應(yīng)答反應(yīng)有賴于輔助性CD4+T細(xì)胞參與。CD4+T輔助性細(xì)胞調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答主要通過分泌細(xì)胞因子發(fā)揮作用,值得注意的是在HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換過程中可觀察到許多重要細(xì)胞因子的變化。在α干擾素治療的HBeAg陽性CHB患者中可觀察到大量增加的具有生物活性的白細(xì)胞介素-12(IL-12)和輔助性T細(xì)胞(Th)1類細(xì)胞因子,重要的是,IL-12高峰出現(xiàn)的時(shí)間正好在HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換之前或與之同步。在慢性HBV感染自然史的研究中也發(fā)現(xiàn)高水平血清IL-12與早期自發(fā)的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換有關(guān)�？梢�,細(xì)胞因子除了在啟動(dòng)和塑造HBV相關(guān)的免疫反應(yīng)方面發(fā)揮決定性作用外,也與HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換這一重要事件相關(guān)。根據(jù)CD4+T細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子和功能可以分為Th1、Th2、Th9、Th17、Th22和Treg等不同亞群,其中,Thl細(xì)胞亞群主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-a等介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。既往研究認(rèn)為,輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的主要是Th2細(xì)胞亞群,其分泌的IL-4、IL-6和IL-10等細(xì)胞因子能促進(jìn)B細(xì)胞增殖以及分化為漿細(xì)胞。近年來,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)一種特殊的Th細(xì)胞位于淋巴濾泡,稱之為濾泡輔助性T (Tfh)細(xì)胞,能夠直接在生發(fā)中心輔助B細(xì)胞參與體液免疫。IL-21是Tfh細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子,對促進(jìn)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞的能力比Th2類細(xì)胞因子如IL-4和IL-10更強(qiáng),被稱之為B細(xì)胞生長因子。另外,近期研究顯示IL-21作為媒介參與CD4+T細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的輔助作用。可見,在慢性病毒感染中,CD4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-21對促進(jìn)B細(xì)胞功能和維持CTL應(yīng)答具有重要作用。IL-21與IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15同屬于I型細(xì)胞因子家族成員,其主要由多種活化的CD4+T細(xì)胞分泌,包括Th17、NKT和Tfh等細(xì)胞亞群。IL-21受體(IL-21R)廣泛表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞等,特別是高表達(dá)于B細(xì)胞。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)非活動(dòng)性HBsAg攜帶者(發(fā)生]HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,病毒呈低復(fù)制水平)的血清IL-21水平和外周血中分泌IL-21的CD4+T細(xì)胞頻數(shù)均顯著增高。結(jié)合既往IL-21在其他慢性病毒,如人類免疫缺陷病毒(HIV)和淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)感染中的作用研究,我們推測,在慢性HBV感染中IL-21可作用于體內(nèi)多種細(xì)胞亞群,通過調(diào)節(jié)機(jī)體天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答在HBV特異性抗體產(chǎn)生和病毒清除方面發(fā)揮重要作用。目的本研究以HBV感染自然史的橫向人群和接受抗病毒治療的CHB患者縱向隊(duì)列為對象,分析IL-21在HBV感染中的特點(diǎn),通過研究IL-21在HBV感染中與Tfh細(xì)胞、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞以及NK細(xì)胞之間的作用,并結(jié)合HBV表達(dá)質(zhì)粒攜帶小鼠模型,探討IL-21在病毒清除和HBV特異性抗體產(chǎn)生中的作用。方法橫向研究對象共納入130例慢性HBV感染患者,包括免疫耐受期患者(IT)20例,HBeAg陽性CHB患者75例,非活動(dòng)性HBsAg攜帶者(IC)35例,55例健康志愿者作為對照組(HC)�？v向研究對象來源于替比夫定治療臨床研究隊(duì)列,共納入108例HBeAg陽性CHB患者,所有研究對象在治療基線、12周、24周和52周收集血清和肝素抗凝血。根據(jù)抗病毒治療52周后應(yīng)答情況分為完全應(yīng)答組(CR)和非完全應(yīng)答組(NCR),CR組定義為達(dá)到HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換伴隨HBV DNA低于檢測下限(2.5 log10 copies/mL),NCR組定義為未獲得HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換或HBV DNA2.5 log10 copies/mL。根據(jù)抗病毒治療52周后HBV DNA水平分為病毒學(xué)應(yīng)答組(VR, HBV DNA2.5 log10 copies/mL)和非病毒學(xué)應(yīng)答組(NVR, HBV DNA2.5 log10 copies/mL)。1.IL-21在HBV感染中的特點(diǎn)1.1選取慢性HBV感染患者和HC,分別采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和熒光定量PCR檢測血清和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC) IL-21的水平,采用免疫組織化學(xué)染色檢測CHB患者和HC肝組織IL-21表達(dá)水平；1.2采用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)方法檢測HBeAg陽性CHB患者Th1、Th2、Th17以及Tfh細(xì)胞亞群IL-21表達(dá)水平；1.3應(yīng)用微量樣本多重蛋白定量(CBA)和ELISA分別檢測縱向隊(duì)列患者各時(shí)間點(diǎn)血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TOF-α、IFN-γ、IL-17和IL-21水平,觀察各指標(biāo)抗病毒治療過程中的動(dòng)態(tài)變化并比較CR組和NCR組各指標(biāo)在不同時(shí)間點(diǎn)的差異。2.IL-21參與CXCR5+CD4+T細(xì)胞對B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究2.1采用流式細(xì)胞術(shù)分析慢性HBV感染患者和HC外周血CXCR5+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)；采用HBV重疊多肽刺激外周血 CXCR5+CD4+T細(xì)胞比較兩組的IL-21分泌水平；2.2采用羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記慢性HBV感染患者PBMC后,應(yīng)用不同濃度的重組HBcAg (rHBcAg)和rHBeAg刺激,檢測CXCR5+CD4+T細(xì)胞的增殖情況；2.3采用流式細(xì)胞術(shù)檢測慢性HBV感染患者(IT、IC和CHB)以及縱向治療隊(duì)列(CR和NCR組)各時(shí)間點(diǎn)外周血CXCR5+CD4+T細(xì)胞亞群頻數(shù),分析抗病毒治療12周CR和NCR組CXCR5+CD4+T細(xì)胞亞群頻數(shù)變化的特點(diǎn)；2.4采用佛波酯／伊諾霉素(PMA/ionomycin)刺激慢性HBV感染患者PBMC,ICS檢測CXCR5+CD4+T和CXCR5-CD4+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子情況；應(yīng)用PMA/ionomycin或HBV重疊多肽刺激CXCR5+CD4+T細(xì)胞,ICS檢測橫向人群和縱向隊(duì)列中該細(xì)胞亞群IL-21分泌水平；2.5流式分選縱向隊(duì)列CR和NCR患者的CXCR5+CD4+T和CXCR5CD4+T細(xì)胞,與同源CD19+B細(xì)胞共培養(yǎng),采用ELISA檢測共培養(yǎng)上清IL-21水平,在共培養(yǎng)體系中應(yīng)用rIL-21R-Fc外源性阻斷IL-21或者加入rIL-21,采用ELISPOT檢測分泌HBeAb的B細(xì)胞頻數(shù)；2.6體外應(yīng)用細(xì)胞因子誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞向CXCR5+CD4+T細(xì)胞分化,流式細(xì)胞術(shù)分析比較慢性HBV感染者和HC,CR組和NCR組患者之間細(xì)胞分化能力的差異；2.7流式細(xì)胞術(shù)分析比較CHB患者外周血CXCR5+CD4+T和CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD-1、ICOS和IL-21表達(dá)水平差異,以及慢性HBV感染后行脾切除術(shù)的肝硬化患者外周血CXCR5+CD4+T細(xì)胞和匹配的脾臟CXCR5+CD4+T細(xì)胞表型分子表達(dá)的差異,分析慢性HBV感染后行脾切除術(shù)的肝硬化患者外周血CXCR5+CD4+T與脾臟ICOS+PD1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)的相關(guān)性。3.IL-21對CD8+T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究3.1磁珠分選慢性HBV感染患者,HC以及替比夫定治療CHB患者基線,12周和24周外周血CD8+T細(xì)胞,采用熒光定量PCR檢測IL-21R表達(dá)水平；3.2不同濃度重組IL-21(rIL-21)體外刺激CHB患者PBMC,流式檢測CD8+T細(xì)胞頻數(shù)和其表型分子CD69、CD45RO和CCR7的表達(dá)以及顆粒酶B、穿孔素和IFN-γ的分泌水平；3.3不同濃度rIL-21和HBV重疊肽體外刺激HLA-A2陽性CHB患者PBMC,采用CFSE染色方法檢測CD8+T細(xì)胞的增殖能力；采用MHC-I Streptamer多聚體染色檢測HBV特異性CD8+T細(xì)胞的頻數(shù)；流式檢測HBV特異性CD8+T細(xì)胞CD69、CD45RO和CCR7的表達(dá)；ICS檢測HBV特異性CD8+T細(xì)胞顆粒酶B、穿孔素和IFN-γ的分泌水平。4.IL-21對NK細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究4.1流式細(xì)胞術(shù)檢測HC和CHB患者外周血NK細(xì)胞表型表達(dá)(CD16、 NKG2A、NKG2D、NKp46);應(yīng)用rIL-12、rIL-15和rIL-18聯(lián)合刺激,ICS檢測IFN-γ分泌；外周血PBMC與已負(fù)載HBVcore18-27肽的T2細(xì)胞(HLA-A2陽性)和TCR-Like抗體共培養(yǎng)6小時(shí)(h),ICS檢測IFN-γ以了解NK細(xì)胞的 ADCC效應(yīng)；4.2磁珠分選CHB患者外周血NK細(xì)胞,應(yīng)用rIL-21體外刺激24h、48h和72h,檢測NK細(xì)胞表型；純化NK細(xì)胞,rIL-21單用或者分別聯(lián)合rIL-12、rIL-15和rIL-18或與三種細(xì)胞因子聯(lián)合體外刺激,ICS檢測NK細(xì)胞IFN-γ分泌；純化NK細(xì)胞在rIL-21刺激3天后,與已負(fù)載HBVcore18-27肽的T2細(xì)胞和TCR-Like抗體共培養(yǎng),ICS檢測IFN-γ以了解IL-21是否可以促進(jìn)NK細(xì)胞的ADCC效應(yīng)；4.3純化NK細(xì)胞以CFSE標(biāo)記,加入rIL-21刺激避光培養(yǎng)7天,流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞增殖；4.4純化NK細(xì)胞以rIL-21單獨(dú)或分別聯(lián)合IL-12、IL-15和IL-18刺激30分鐘,采用Phosflow的方法流式細(xì)胞術(shù)檢測信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物3 (STAT3)和STAT4磷酸化水平。5.IL-21在HBV表達(dá)質(zhì)粒攜帶小鼠模型中的研究5.1采用尾靜脈高壓注射pSM2質(zhì)粒(10μg/只)至野生型C57BL/6小鼠和IL-21R基因敲除小鼠,以及pUC19質(zhì)粒(10gg/只)至野生型C57BL/6小鼠建模,在注射后各時(shí)間點(diǎn)眼眶后取血留取血清檢測HBsAg、HBsAb和IL-21。分離外周血和肝內(nèi)淋巴細(xì)胞進(jìn)行流式檢測分析；留取肝組織進(jìn)行HE染色、免疫組化分析和檢測IL-21mRNA水平；5.2采用尾靜脈注射rAAV8-1.3HBV至野生型C57BL/6小鼠體內(nèi),在注射后各時(shí)間點(diǎn)眼眶后采血,收集血清檢測HBsAg。12周后根據(jù)HBsAg水平對小鼠進(jìn)行配對分組,實(shí)驗(yàn)組予尾靜脈注射小鼠IL-21-GFP-重組腺病毒,尾靜脈注射空載GFP重組腺病毒或PBS作為對照,在注射第1、4、7、10和13天眼眶后取血留取血清檢測IBsAg、HBsAb和IL-21。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)或四分位間距表示。計(jì)數(shù)資料采用列聯(lián)表卡方檢驗(yàn)；兩組間計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),不滿足方差分析條件時(shí)采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)Mann-Whitney U檢驗(yàn)；配對樣本不同處理的計(jì)量資料采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。多組間計(jì)量資料采用單因素方差分析,不滿足方差分析條件時(shí)采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),多個(gè)相關(guān)樣本采用Friedman M檢驗(yàn),多重比較采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)；縱向研究中樣本重復(fù)測量數(shù)據(jù)比較采用一般線性模型重復(fù)測量分析,保守Greenhouse-Geisser法校正得到的交互效應(yīng)的P值用于單變量分析,不同時(shí)間點(diǎn)組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0和Graphpad Prism 5.0進(jìn)行處理及構(gòu)圖,所有統(tǒng)計(jì)分析基于雙側(cè)假設(shè)檢驗(yàn),以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.IL-21在HBV感染中的特點(diǎn)1.1慢性HBV感染患者血清IL-21濃度和外周血PBMC IL-21mRNA表達(dá)水平均顯著高于HC(P0.001；P0.001),免疫組化染色顯示CHB患者肝內(nèi)IL-21表達(dá)較HC明顯增強(qiáng)；1.2 CHB患者IL-21主要來源于CD4+Th細(xì)胞,其中Th1、Th2、Th17以及Tfh細(xì)胞亞群均可分泌IL-21,以Thl和Tfh細(xì)胞亞群明顯,兩者表達(dá)水平均顯著高于Th2和Th17細(xì)胞亞群；1.3動(dòng)態(tài)觀察48例接受替比夫定治療52周的HBeAg陽性CHB患者各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子變化,結(jié)果顯示血清TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17和IL-21水平隨抗病毒治療而下降,治療52周時(shí)水平較基線相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001; P=0.002; P0.001; P0.001; P0.001; P=0.007),血清IFN-γ和IL-4水平在治療前后變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；CR組患者(n=7)抗病毒治療12周血清IL-21水平顯著高于NCR組(n=41)(P=0.022)。2.IL-21參與CXCR5+CD4+T細(xì)胞對B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究2.1采用PMA/ionomycin非特異刺激慢性HBV感染患者PBMC,結(jié)果顯示CXCR5+CD4+T細(xì)胞主要分泌IL-21,其表達(dá)量明顯高于其分泌的IL-4、IL-17和IFN-γ(P0.001),而CXCR5-CD4+T細(xì)胞則以分泌IFN-y為主；2.2慢性HBV感染者外周血CXCR5+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)顯著高于HC(P0.001)。HBV重疊多肽刺激CXCR5+CD4+T細(xì)胞,雖然僅有小部分細(xì)胞能分泌IL-21,但是慢性HBV感染者HBV特異性IL-21分泌水平顯著高于HC組(P0.001)。采用不同濃度的rHBcAg和rHBeAg刺激CFSE標(biāo)記的PBMC檢測CXCR5+CD4+T細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果顯示rHBcAg和rHBeAg刺激CXCR5+CD4+T細(xì)胞增殖呈劑量依賴性,高濃度rHBcAg可促進(jìn)CXCR5+CD4+T細(xì)胞增殖,但過高濃度rHBeAg則抑制該細(xì)胞亞群增殖；2.3橫向研究顯示能夠發(fā)生自發(fā)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的IC組,其外周血CXCR5+CD4+T細(xì)胞亞群的頻數(shù)顯著高于未發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的IT組(P0.001)和CHB組(P0.001)患者�？v向研究結(jié)果顯示,能夠發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的CR組(n=16)患者,其CXCR5+CD4+T細(xì)胞亞群的頻數(shù)在12周、24周和52周這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于NCR組(n=26)患者(P0.05),重復(fù)測量結(jié)果顯示CR組患者總體CXCR5+CD4+T細(xì)胞亞群頻數(shù)顯著高于NCR組患者(P=0.009)。CR組中87.5%患者(14/16)在抗病毒治療12周后其CXCR5+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)呈升高趨勢,而NCR組中只有50%的患者(13/26)呈現(xiàn)上升趨勢,顯著低于CR組(P=0.014)；相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)12周CXCR5+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)和基線之間的差值與血清HBeAg在12周和基線之間的差值成負(fù)相關(guān)(r=-0.358,P=0.020),即CXCR5+CD4+T細(xì)胞抗病毒治療12周后頻數(shù)增加幅度與HBeAg降低幅度正相關(guān)；2.4采用PMA/ionomycin刺激橫向研究患者CXCR5+CD4+T細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IC組患者IL-21+CXCR5+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)顯著高于CHB、IT和HC組(P0.001)。HBV重疊多肽刺激發(fā)現(xiàn)IL-21+CXCR5+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)在IC組患者中最高(P0.001)；縱向隊(duì)列中的結(jié)果顯示抗病毒治療24周和52周時(shí),CR組(n=12)患者HBV特異性IL-21+CXCR5+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)顯著高于NCR組(n=15)(P=0.005；P=0.002)；2.5分選縱向隊(duì)列患者CXCR5+CD4+T或CXCR5-CD4+T細(xì)胞與同源CD19+B細(xì)胞共培養(yǎng),ELISPOT檢測發(fā)現(xiàn)無論是CR組或NCR組,其CXCR5+CD4+T細(xì)胞均能促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生HBV相關(guān)抗體。在發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的CR組(n=10)患者,其B細(xì)胞在CXCR5+CD4+T細(xì)胞輔助下分泌HBeAb水平顯著高于NCR組(n=10)患者(P=0.011)。ELISA檢測培養(yǎng)上清IL-21水平,結(jié)果顯示無論是CR組或NCR組,CXCR5+CD4+T細(xì)胞與B細(xì)胞共培養(yǎng)上清的IL-21水平顯著高于CXCR5"CD4+T細(xì)胞(P=0.007；P=0.013)。體外CXCR5+CD4+T細(xì)胞與B細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入 rIL-21R-Fc阻斷IL-21后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分泌HBeAb的B細(xì)胞頻數(shù)顯著降低(P=0.027)。在CXCR5-CD4+T細(xì)胞與B細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入rIL-21后,分泌HBeAb的B細(xì)胞頻數(shù)顯著增加(P=0.043)；2.6慢性HBV感染者和HC初始CD4+T細(xì)胞在體外均能成功誘導(dǎo)為CXCR5+CD4+T細(xì)胞,CR組(n=6)患者和NCR (n=6)患者其初始CD4+T細(xì)胞分化為CXCR5+CD4+T細(xì)胞能力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.59)；2.7 CHB患者外周血CXCR5+CD4+T細(xì)胞PD-1、ICOS和IL-21表達(dá)水平均明顯高于CXCR5-CD4+T細(xì)胞(P0.001)。慢性HBV感染后行脾切除術(shù)的肝硬化患者脾臟CXCR5+CD4+T細(xì)胞和其配對的外周血CXCR5+CD4+T細(xì)胞均高表達(dá)CD45RO,脾臟CXCR5+CD4+T細(xì)胞則高表達(dá)ICOS, PD-1和CD69(P=0.005),而外周血CXCR5+CD4+T細(xì)胞則高表達(dá)CCR7 (P=0.003)。慢性HBV感染后行脾切除術(shù)的肝硬化患者(n=10)外周血CXCR5+CD4+T細(xì)胞與脾臟ICOS+PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞的頻數(shù)呈正相關(guān)(r=0.723,P=0.018)。3.IL-21對CD8+T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究3.1慢性HBV感染者外周血CD8+T細(xì)胞IL-21R mRNA水平顯著高于HC組(P0.001)。病毒學(xué)應(yīng)答組(VR) CHB患者12周CD8+T細(xì)胞IL-21R mRNA水平較基線顯著降低(P=0.017), NVR組12周CD8+T細(xì)胞IL-21R mRNA水平呈增加趨勢,與基線相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但顯著高于VR組患者(P=0.007)；3.2 rIL-21體外刺激可促進(jìn)CHB患者CD8+T細(xì)胞CD69表達(dá)(P=0.035),顆粒酶B(P0.001)和穿孔素的分泌(P=0.004)。在HBV重疊肽的作用下,rIL-21可增加HBV Core特異性CD8+T細(xì)胞頻數(shù)(P--0.012)和HBV特異性顆粒酶B的分泌(P=0.047),但未能明顯增強(qiáng)穿孔素和IFN-y表達(dá)。4.IL-21對NK細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究4.1 CHB患者外周血NK細(xì)胞抑制性受體NKG2A和激活性受體NKp46表達(dá)頻數(shù)顯著高于HC(P0.001；P=0.001),而激活性受體CD16和NKG2D表達(dá)則顯著降低(P=0.001；P=0.042)。與HC相比,CHB患者外周血NK細(xì)胞介導(dǎo)ADCC的能力和分泌IFN-γ水平顯著降低(P0.001；P=0.017)；4.2體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rIL-21可顯著上調(diào)CHB患者NK細(xì)胞CD16、NKp46和NKG2D表達(dá)(P0.001)。單用rIL-21刺激可提高NK細(xì)胞分泌IFN-γ,并促進(jìn)rIL-12、rIL-15和rIL-18對NK細(xì)胞IFN-y分泌的作用。rIL-21可顯著提高NK細(xì)胞ADCC效能和增殖能力(P=0.008；P=0.022)；5.IL-21在HBV表達(dá)質(zhì)粒攜帶小鼠模型中的研究5.1高壓尾靜脈注射pSM2質(zhì)粒的野生型C57BL/6小鼠外周血和肝內(nèi)IL-21水平,CXCR5+CD4+T細(xì)胞以及CD19+B細(xì)胞的頻數(shù)均較對照組小鼠顯著升高(P0.05)；5.2高壓尾靜脈注射pSM2質(zhì)粒的IL-21R基因敲除小鼠在注射后第10天、13天和16天血清檢測HBsAg仍為陽性,HBsAg水平均顯著高于野生型小鼠(P=0.003；P=0.002；P=0.010)。所有IL-21R基因敲除小鼠均未檢測到HBsAb;5.3尾靜脈注射小鼠IL-21-GFP-重組腺病毒可促進(jìn)rAAV8-1.3HBV病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)法建立的HBV持續(xù)表達(dá)小鼠的HBsAg清除和HBcAb產(chǎn)生。結(jié)論1.CHB患者血清和肝內(nèi)IL-21水平均高于HC組,CHB患者替比夫定治療12周血清IL-21水平能預(yù)測治療52周HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,提示IL-21可作為CHB患者抗病毒療效評價(jià)的免疫學(xué)指標(biāo)；2. CXCR5+CD4+T細(xì)胞的頻數(shù)在發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的慢性HBV感染者更高,其可通過分泌IL-21促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生HBeAb,提示通過擴(kuò)增CXCR5+CD4+T細(xì)胞或促進(jìn)IL-21表達(dá)可能有助于CHB患者的優(yōu)化治療；3.rIL-21體外刺激可促進(jìn)CHB患者CD8+T細(xì)胞活化,增強(qiáng)HBV特異性和非特異性CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性,提示其在促進(jìn)肝臟炎癥和損傷中發(fā)揮作用：4.慢性HBV感染可導(dǎo)致NK細(xì)胞功能受損,rIL-21可促進(jìn)慢性HBV感染患者NK細(xì)胞IFN-y分泌和ADCC功能,增強(qiáng)其抗病毒效應(yīng),提示IL-21靶向重塑NK細(xì)胞功能的免疫策略可能有助于控制慢性HBV感染；5.HBV表達(dá)質(zhì)粒攜帶小鼠模型的體內(nèi)研究表明IL-21在HBsAg清除和HBV特異性抗體產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

型肝炎（ＣＨＢ）患者約２０００萬例Ｗ。因化慢性冊Ｖ感染已經(jīng)成為嚴(yán)重影響我??國人民健康的公共衛(wèi)生問題。??慢性ＨＢＶ感染是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，其自然史可分為Ｗ下五個(gè)時(shí)期（圖１），但??這個(gè)五個(gè)時(shí)期并非都是連續(xù)的。（１）免疫耐受期，此期特點(diǎn)為血清乙型肝炎病??毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和乙型肝炎病毒ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）陽性，血清ＨＢＶＤＮＡ??水平較高（＞ｌ〇５ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ），血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ＡＬＴ）水平正常，肝組織??學(xué)無病變或培微病變。免疫耐受常見于ＨＢｅＡｇ陽性母親垂直傳播導(dǎo)致的嬰幼兒??ＨＢＶ感染，其發(fā)生的機(jī)制目前尚不清楚，有可能由于在圍產(chǎn)期接觸ＨＢＶ，免疫??系統(tǒng)將ＨＢＶ抗原劃歸自身抗原范疇加Ｗ保護(hù)，導(dǎo)致針對ＨＢＶ抗原的Ｔ細(xì)胞克??隆缺失或克隆無能，機(jī)體的免疫反應(yīng)無法被激活。酉生期感染所致的免疫耐受??期可持續(xù)１０－３０年，自發(fā)ＨＢｅＡｇ血清學(xué)轉(zhuǎn)換發(fā)生率較低。（２）免疫清除期，此??期Ｗ反復(fù)肝炎活動(dòng)和緩解為特征

抗體；第四階段：記憶性Ｂ細(xì)胞活化產(chǎn)生抗體。當(dāng)機(jī)體再次遭遇同一特異性抗??原，記憶性Ｂ細(xì)胞迅速活化，增殖分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生大量高親和力的特異性??抗體（圖２）。??４??

?？?Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ?ｖｕｅｅｋ??圖１－３?ＣＨＢ患者血清多種細(xì)胞因子濃度在替比夫定抗病毒治巧５２周動(dòng)態(tài)變化??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３?Ｔｈｅ?ｌｏｎｇｉＵｉｄｉｎａｌ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｍｕｌｔｉｐｌｅ?ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ?ｌｅｖｅｌｓ?ｉｎ?ＣＨＢ?ｐａｔｉｅｎｔｓ?ｄｕｒｉｎｇ?５２??ｗｅｅｋｓ?ｏｆ?ｔｅｌｂｉｖｕｄｉｎｅ?ｔｈｅｒａｐｙ．??（５）
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本文編號(hào)：2853614