第一部分血清miRNAs作為肺結(jié)核病新分子標(biāo)志物的篩選與鑒定 研究背景：結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)引起的慢性感染性疾病,可侵及許多臟器,以肺部結(jié)核(Pulmonary Tuberculosis, PTB)感染最為常見,占各器官結(jié)核病總數(shù)的80-90%,發(fā)展成為肺結(jié)核病。肺結(jié)核病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。肺結(jié)核病防治最突出的難點(diǎn)是缺乏疾病特異性的早期診斷標(biāo)志物,無法獲得早期診斷,導(dǎo)致肺結(jié)核病高發(fā)和死亡率的上升。為此,迫切需要研究肺結(jié)核病特異生物學(xué)標(biāo)志物,建立一種快速、敏感、高效的肺結(jié)核病診斷和鑒別的新方法,防止肺結(jié)核病蔓延。本研究從血清miRNAs的表達(dá)譜中,篩選能作為肺結(jié)核病生物標(biāo)志物,建立血清miRNA組合物,作為臨床診斷的潛在新分子標(biāo)志物。 研究方法：本研究收集血清樣本326例,其中健康對照者108例,肺結(jié)核病患者128例,鑒別診斷組疾病患者90例,包括肺癌、肺炎和慢性阻塞性病患者各30例。應(yīng)用Solexa測序技術(shù)進(jìn)行初步篩查,檢測20例肺結(jié)核病患者和20例健康對照者中血清miRNAs;應(yīng)用熒光定量PCR方法,在108例肺結(jié)核病患者、88例健康對照者,以及90例鑒別診斷組疾病患者血清樣本中驗(yàn)證差異表達(dá)的血清miRNAs;通過ROC曲線和Logistic回歸模型分析,對單個(gè)血清miRNAs和miRNAs組合對肺結(jié)核病診斷的靈敏度和特異性進(jìn)行比較和分析；最后應(yīng)用預(yù)測miRNAs調(diào)控的靶基因和全基因組轉(zhuǎn)錄概況,構(gòu)建與肺結(jié)核病相關(guān)的靶基因和miRNAs的網(wǎng)絡(luò)圖。 研究結(jié)果：應(yīng)用Solexa測序技術(shù)檢測肺結(jié)核病患者和健康對照者的血清miRNAs,在肺結(jié)核病患者中,選擇具有顯著性差異的15個(gè)血清miRNAs,其中10個(gè)血清miRNAs表達(dá)量上調(diào),5個(gè)血清miRNAs表達(dá)量下調(diào)；通過熒光定量PCR方法發(fā)現(xiàn),在肺結(jié)核病患者和健康對照者中,有6個(gè)血清miRNAs (hsa-miR-378、 hsa-miR-483-5p、hsa-miR-22、hsa-miR-29c、hsa-miR-101和hsa-miR-320b)具有顯著性差異(P0.001)。并且在肺結(jié)核患者和鑒別診斷組之間進(jìn)行比較均具有顯著性差異(P0.05)；通過對這6個(gè)血清miRNAs單個(gè)的ROC曲線進(jìn)行分析,顯示單個(gè)血清niRNAs的AUC在0.702到0.880之間；通過Logistic回歸模型方法計(jì)算6個(gè)血清miRNAs組合物的AUC為0.982(95%CI,0.929-0.998),靈敏度為95.0%和特異性為91.8%。MiRNAs-Gene網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖顯示miRNAs可能是調(diào)控機(jī)體的免疫通路相關(guān)基因,參與肺結(jié)核病的發(fā)生過程。 結(jié)論：(1)建立Solexa測序技術(shù)結(jié)合qRT-PCR檢測技術(shù),可快速穩(wěn)定靈敏地構(gòu)建肺結(jié)核血清miRNAs指紋圖譜檢測技術(shù)；(2)篩選了肺結(jié)核病相關(guān)特異的6個(gè)血清miRNAs,為建立肺結(jié)核病臨床早期快速特異診斷的標(biāo)準(zhǔn),提高肺結(jié)核病的防治水平奠定基礎(chǔ)；(3)鑒定和構(gòu)建血清miRNAs組合可能是肺結(jié)核病的診斷潛在的新分子標(biāo)志物,為進(jìn)一步研究miRNAs在肺結(jié)核病中的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 第二部分Mir-146a, miR-149, miR-196a2和miR-499SNPs與中國維吾爾族、哈薩克族和南方漢族人群肺結(jié)核病易感性的研究 研究目的：MiRNAs是一類非編碼RNA,以mRNA為靶標(biāo)并抑制mRNA表達(dá)蛋白。單核苷酸多態(tài)性發(fā)生在miRNAs的前體中,通過影響miRNAs的表達(dá)或者成熟導(dǎo)致其正常功能的發(fā)揮,并且可能通過修飾miRNAs調(diào)控影響表型類型和疾病易感性。人類miRNAs基因中的數(shù)個(gè)SNP可能影響miRNAs的生物合成和功能,可能參與肺結(jié)核病的發(fā)生機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)首次研究miR-146a C﹥G、miR-149T﹥C、miR-196a2T﹥C和miR-499A﹥G SNPs位點(diǎn)與中國維吾爾族、哈薩克族和南方漢族人群肺結(jié)核病易感性,揭示這4個(gè)miRNAs SNPs位點(diǎn)基因可能是肺結(jié)核病的候選易感基因。 研究方法：應(yīng)用PCR-PFLR方法分析SNPs的分布頻率。本研究共收集654例南方漢族人群血樣(健康對照組300例,肺結(jié)核病組354例)、662例維吾爾族人群血樣(健康對照組361例,肺結(jié)核病組301例)和612例哈薩克族人群血樣(健康對照組361例,肺結(jié)核病組251例)。對基因型及基因頻率分布進(jìn)行檢測,并對遺傳模式和連鎖不平衡進(jìn)行分析。 研究結(jié)果：在維吾爾族人群中miR-499A﹥G SNP位點(diǎn)的等位基因A(P=0.003； OR=1.563;95%CI,1.162-2.103)和基因型GG型(P=0.001; OR=5.344；95%CI,1.803-15.83)在肺結(jié)核病組和健康對照組之間存在顯著性差異；在年齡和性別校正后,發(fā)現(xiàn)miR-499A﹥G SNP位點(diǎn)在共顯性(P=0.0014；OR=5.37；95%CI,1.81-15.92)、顯性(P=0.029；OR=1.47；95%CI,1.04-2.09)、隱性(P=7e-04；OR=4.95；95%CI,1.68-14.55)和加性模式(P=0.0027; OR=1.57；95%CI,1.16-2.11)下與肺結(jié)核病存在顯著相關(guān)性；連鎖不平衡分析,發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的單體型CTCC與肺結(jié)核病的發(fā)生具有顯著相關(guān)性(P=0.044; OR=7.19；95%CI,1.01-51.14); MiR-146a C﹥G、miR-149T﹥C和miR-196a2T﹥C SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型在肺結(jié)核病組和健康對照組之間的分布均無顯著性差異(P0.05)。在哈薩克族人群中,miR-146a C﹥G位點(diǎn)的等位基因G (P=0.023；OR=1.33;95%CI,1.04-1.69)和CC型(P=O.013；OR=1.84；95%CI,1.14-2.98)在兩組之間存在顯著性差異；同時(shí)miR-196a2T﹥C SNP位點(diǎn)的等位基因C(P=0.008；OR=O.73；95%CI,0.58.0.92)和基因型TT型(P=0.013；OR=0.54；95%CI,0.33-0.88)在兩組之間存在顯著性差異；經(jīng)年齡和性別校正后,發(fā)現(xiàn)miR-146a C﹥G SNP位點(diǎn)在共顯性(P=0.019；OR=1.87；95%CI,1.15-3.03)、隱性(P=0.005；OR=1.84；95%CI,1.20-2.81)和加性模式(P=0.022；OR=1.33；95%CI,1.04-1.69)下與肺結(jié)核病存在顯著相關(guān)性；miR-196a2T﹥C SNP位點(diǎn)在共顯性(P=O.029；OR=0.54；95%CI,0.33-0.88)、顯性(P=0.014；OR=0.65；95%CI,0.46-0.92)和加性模式(P=0.0083；OR=0.73；95%CI,0.58-0.92)下與肺結(jié)核病存在顯著相關(guān)性；miR-149T﹥C和miR-499A﹥G SNPs位點(diǎn)的基因型頻率在健康對照組與肺結(jié)核病組之間的分布均無顯著性差異(P0.05)。在南方漢族人群中,構(gòu)建的單體型TCCC (P=0.044; OR=0.23；95%CI,0.05-0.96)和CCCT(P=0.024；OR=0.03；95%CI,0.01-0.63)與肺結(jié)核病的保護(hù)效應(yīng)具有顯著相關(guān)性。 結(jié)論：(1)利用病例-對照方法,結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,首次對miR-499A﹥G、 miR-146a C﹥G、miR-149T﹥C和miR-196a2T﹥C SNPs位點(diǎn)與中國維吾爾族、哈薩克族和南方漢族人群結(jié)核病的易感性進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究；(2) miR-499A﹥G SNP位點(diǎn)與維吾爾族人群肺結(jié)核病的易感性相關(guān),可能增加肺結(jié)核病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；miR-146a C﹥G、 miR-149T﹥C和miR-196a2T﹥C SNPs與維吾爾族人群肺結(jié)核病的不存在相關(guān)性；(3) miR-146a C﹥G和miR-196a2T﹥C SNPs位點(diǎn)與哈薩克族人群肺結(jié)核病發(fā)生的相關(guān)；miR-149T﹥C和miR-499A﹥G SNPs與哈薩克族人群肺結(jié)核病的不存在相關(guān)性；(4) miR-146a C﹥G、miR-149T﹥C、 miR-196a2TC和miR-499A﹥G SNPs位點(diǎn)與中國南方漢族肺結(jié)核病易感不存在相關(guān)性。提示miRNA SNPs與肺結(jié)核易感具有種族差異性。 第三部分在中國維吾爾族、哈薩克族和南方漢族人群中的MRCl基因多態(tài)性與肺結(jié)核病易感性的研究 研究背景：機(jī)體識別結(jié)核分枝桿菌并介導(dǎo)免疫應(yīng)答主要依賴T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞表面的模式識別受體(Pattern Recognition Receptors, PRRs)。 MRC1基因編碼的PRRs家族的甘露糖受體,屬于C型凝集素超家族成員,可通過胞外區(qū)識別和結(jié)合結(jié)核分枝桿菌、遞呈抗原和保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮作用。目前尚沒有MRC1基因SNPs與結(jié)核病易感性報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究中國新疆地區(qū)維吾爾族、哈薩克族和南方漢族人群MRC1基因第7號外顯子基因多態(tài)性與肺結(jié)核病易感性,揭示MRC1基因可能是肺結(jié)核病的候選易感基因。 研究方法：應(yīng)用PCR和DNA測序技術(shù),對中國新疆地區(qū)595例維吾爾族人群血樣(健康對照組345例,肺結(jié)核病組250例)、513例哈薩克族人群血樣(健康對照組325例,肺結(jié)核病組188例)和454例南方漢族人群血樣(健康對照組226例,肺結(jié)核病組230例)MRC1基因第7號外顯子的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性(G1186A、G1195A、T1212C、C1221G、C1303T和C1323T)基因型及基因頻率分布進(jìn)行檢測,并對6個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析。 研究結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)在維吾爾族人群中MRC1基因的G1186A位點(diǎn)的等位基因G的分布頻率在肺結(jié)核病組(0.464)中低于健康對照組(0.536),并且在維吾爾族肺結(jié)核病組和健康對照組之間的分布具有顯著性差異(P=0.029；OR=1.29；95%CI,1.02-1.63)；基因型分析發(fā)現(xiàn)MRCl基因的G1186A位點(diǎn)基因型AA型在肺結(jié)核病組的頻率低于健康組,在兩組之間也存在顯著性差異(P=0.037；OR=1.66；95%CI,1.05-2.61)；在年齡和性別校正后,MRC1基因的G1186A位點(diǎn)在加性模式下與肺結(jié)核病存在相關(guān)性(P=0.039；OR=1.27；95%CI,1.01-1.60)。從MRC1基因SNPs位點(diǎn)的連鎖不平衡分析,發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的GGTCCT單體型(P=0.034；OR=0.75；95%CI,0.57-0.98)和GGTCCC單體型(P=0.043；OR=0.57;95%CI,0.33-0.98)與肺結(jié)核病存在顯著的相關(guān)性,其余5個(gè)SNP位點(diǎn)(G1195A、T1212C、 C1221G、C1303T和C1323T)與肺結(jié)核病的易感性不存在顯著相關(guān)性(P0.05)。在哈薩克族人群中發(fā)現(xiàn)MRCl基因的6個(gè)SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率在肺結(jié)核病組和健康對照組之間的分布均無顯著性差異(P0.05)。在漢族人群中MRCl基因的G1186A等位基因G的分布頻率在肺結(jié)核病組中高于正常健康組,兩組間分布存在顯著差異(P=0.023；OR:0.76；95%CI,0.57-0.95)。基因型分析也表明該位點(diǎn)的AG型在漢族人群正常健康組與肺結(jié)核病存在顯著相關(guān)性(P=0.0076; OR=0.55；95%CI,0.36-0.85)。在年齡和性別校正后,G1186A位點(diǎn)在顯性(P=0.0057；OR=0.57；95%CI,0.38-0.85)、超顯性(P=0.039；0R=0.68;95%CI,0.47-0.98)和加性模式(P=0.03；OR=0.75;95%CI,0.58-0.97)下,與肺結(jié)核病存在顯著相關(guān)性。而其它5個(gè)SNP位點(diǎn)(G1195A、T1212C、C1221G、C1303T和C1323T)與肺結(jié)核病無相關(guān)性(P0.05) 結(jié)論：(1)利用病例-對照方法,結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,首次對MRCl基因第7號外顯子區(qū)域的6個(gè)SNPs位點(diǎn)與中國維吾爾族、哈薩克族和南方漢族人群結(jié)核病的易感性進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究；(2)MRC1基因的G1186A位點(diǎn)與維吾爾族人群肺結(jié)核病的易感性相關(guān),可能增加肺結(jié)核病發(fā)病率；可能是南方漢族人群肺結(jié)核的保護(hù)因子,并且可能減少中國漢族人群感染肺結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)；與哈薩克族肺結(jié)核病的易感性沒有關(guān)聯(lián)；(3)MRC1基因的G1195A、T1212C、C1221G、C1303T和C1323T SNPs與中國維吾爾族、哈薩克族和南方漢族肺結(jié)核病均不存在顯著的相關(guān)性。結(jié)果表明,肺結(jié)核病的易感性可能與遺傳因素造成的個(gè)體差異密切相關(guān),同時(shí)為闡明中國人群肺結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制,提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R521
【文章目錄】：
致謝
基金資助
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分 血清miRNAs作為肺結(jié)核病新分子標(biāo)志物的篩選與鑒定
    1 前言
    2 材料
    3 方法
    4 結(jié)果
    5 討論
    6 結(jié)論
第二部分 MiR-146a,miR-149,miR-196a2和miR-499 SNPs與中國維吾爾族、哈薩克族和南方漢族人群肺結(jié)核病易感性的關(guān)聯(lián)研究
    7 前言
    8 材料
    9 方法
    10 結(jié)果
    11 討論
    12 結(jié)論
第三部分 在中國維吾爾族、哈薩克族和南方漢族人群中的MRCl基因多態(tài)性與肺結(jié)核病易感性的研究
    13 前言
    14 材料
    15 方法
    16 結(jié)果
    17 討論
    18 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
作者簡歷及在讀期間所取得的科研成果

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2846717