背景:到目前為止,艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)仍是在全世界范圍內(nèi)一種難以治愈的傳染病,危害人們的健康。艾滋病由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)攻陷人體的CD4~+T免疫細(xì)胞所引發(fā)。在過去20年,隨著抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(antiretroviral therapy,ART)的出現(xiàn),艾滋病從一種致死性疾病轉(zhuǎn)變成一種可控的慢性病。經(jīng)過ART治療的HIV感染者體內(nèi)的CD4~+T細(xì)胞數(shù)會恢復(fù)到正常,并且血液內(nèi)的病毒含量降到臨床的檢測線以下,基本可以擁有和正常人一樣的壽命。但是由于HIV儲存庫的存在,ART并不能徹底清除HIV感染者體內(nèi)的病毒基因,需要感染者終生服藥。HIV儲存庫主要由靜息CD4~+T細(xì)胞構(gòu)成,當(dāng)然也有少量的其他細(xì)胞,例如幼稚CD4~+T、巨噬細(xì)胞等。在這些細(xì)胞中,HIV將自身的核酸通過反轉(zhuǎn)錄整合入細(xì)胞的基因組中,但不進(jìn)行病毒復(fù)制,只是潛伏存在于細(xì)胞的基因組中。這些被HIV潛伏感染的靜息CD4~+T細(xì)胞,可以在人體中長期穩(wěn)定存在,不能被ART藥物或自身免疫系統(tǒng)清除。如果HIV感染者停止ART治療,潛伏感染的HIV會在某些刺激下進(jìn)行復(fù)制,導(dǎo)致血漿病毒反彈。所以,目前治愈HIV感染的最大障礙就是存在難以清除的HIV儲存庫。為了徹底清除HIV儲存庫,“shock and kill”治療策略被提出。該策略的治療理念是先激活潛伏的HIV,再通過ART或免疫細(xì)胞清除產(chǎn)生的病毒或宿主細(xì)胞,從而達(dá)到徹底清除病毒的目的。激活潛伏的HIV需要潛伏期逆轉(zhuǎn)劑(latency-reversing agent,LRA)來完成。LRA種類很多,大部分處于臨床前的研究階段,目前還沒有哪一個LRA能夠在體內(nèi)徹底逆轉(zhuǎn)HIV的潛伏狀態(tài)。在靜息CD4~+T細(xì)胞中的HIV基因沉默與HIV啟動子長末端重復(fù)序列(long terminal repeat,LTR)區(qū)域的組蛋白去乙酰化密切相關(guān)。組蛋白去乙�；�(histone deacetylase,HDAC)向HIV啟動子區(qū)域的核小體募集,導(dǎo)致HIV基因的轉(zhuǎn)錄抑制。這種轉(zhuǎn)錄抑制可由組蛋白去乙�；敢种苿�(histone deacetylase inhibitor,HDACI)來逆轉(zhuǎn)。HDACI屬于LRA中的一大類,通過抑制HDAC的活性來促使LTR區(qū)域的核小體中的組蛋白乙�；�,使DNA與核小體結(jié)合松弛,利于轉(zhuǎn)錄因子的介入,從而引發(fā)潛伏HIV的轉(zhuǎn)錄激活�；谏厦娴臋C(jī)制,一系列HDACI作為“shock and kill”療法的激活劑被廣泛研究。其中一些抑制劑,如伏立諾他(vorinostat,SAHA)和帕比司他(panobinostat)等在體外和體內(nèi)顯示出了一定的潛伏重激活能力,并已經(jīng)完成了臨床實驗,但是它們對HIV儲存庫的激活效能還遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法達(dá)到徹底治愈HIV的程度。目的:為了解決HDACI激活效率不高的問題,本文提出了兩種解決方案。一是尋找新型高效的HDACI來滿足“shock and kill”治療策略的需要;二是通過納米技術(shù)來提高目前已有HDACI的潛伏HIV激活效率。在這項研究中,我們分兩部分內(nèi)容對上述兩種解決方案分別進(jìn)行了相關(guān)研究。方法與結(jié)果:一、發(fā)現(xiàn)新型組蛋白去乙酰酶抑制劑西達(dá)本胺具有激活潛伏HIV的潛能本章內(nèi)容對新型HDACI西達(dá)本胺(chidamide)的潛伏HIV激活能力做了初步評價。西達(dá)本胺是我國首個自主研發(fā)的本酰胺類HDACI,被國家食品藥品監(jiān)督管理總局(China Food and Drug Administration,CFDA)批準(zhǔn)用于治療外周T細(xì)胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphoma,PTCL)。在本章研究中,我們通過以下實驗在細(xì)胞水平證實了西達(dá)本胺對潛伏HIV的重激活作用。(1)我們利用組蛋白去乙�；富钚詸z測試劑盒,確定了西達(dá)本胺對HDAC的抑制作用,為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。(2)我們通過MTS法檢測了西達(dá)本胺的細(xì)胞毒性,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)西達(dá)本胺具有較小的細(xì)胞毒性。(3)接下來我們利用三種不同的HIV潛伏感染細(xì)胞模型,在三個層次對西達(dá)本胺的潛伏HIV重激活能力進(jìn)行了驗證。首先我們利用假病毒細(xì)胞系J-Lat Tat-GFP clone A7、J-Lat Tat-GFP clone A72和TZM-bl,檢測其中的報告基因綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)和熒光素酶來驗證西達(dá)本胺激活HIV啟動子的能力。然后利用含有HIV完整基因組的潛伏感染細(xì)胞系U1/HIV,通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測其分泌到細(xì)胞上清中的p24來證明西達(dá)本胺激活潛伏HIV的作用。最后我們招募了9名經(jīng)過ART治療的HIV感染者,其血液病毒含量已低于臨床檢測水平。我們從他們的血液樣本中分選出了靜息CD4~+T細(xì)胞,再給予西達(dá)本胺治療,檢測細(xì)胞上清中的病毒載量。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)西達(dá)本胺能夠促使其中7名HIV感染者的樣本重新出現(xiàn)HIV,說明西達(dá)本胺不僅可以激活細(xì)胞系中的潛伏HIV,也能夠激活原代靜息CD4~+T細(xì)胞中的潛伏病毒基因。(4)通過染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)實驗對西達(dá)本胺的作用機(jī)制進(jìn)行探討。實驗結(jié)果證明了西達(dá)本胺是通過提高HIV啟動子區(qū)域的組蛋白乙酰化水平來激活潛伏HIV的轉(zhuǎn)錄。通過本章的研究,我們完成了西達(dá)本胺在細(xì)胞水平對潛伏HIV重激活的評價,證實了西達(dá)本胺具有激活HIV儲存庫的潛能,為后續(xù)的臨床研究奠定了細(xì)胞學(xué)的實驗基礎(chǔ)。二、利用納米技術(shù)提高組蛋白去乙酰化酶抑制劑對潛伏HIV的激活能力帕比司他是HIV儲存庫重激活領(lǐng)域研究最為前沿的HDACI之一,已經(jīng)完成了相關(guān)的臨床試驗。但仍然存在很多不足,比如激活效率無法滿足治療要求、溶解度差、毒副作用高等缺點。因此急需一種方法來解決這些問題,提高激活效率、降低毒性。一個有希望的方法是利用納米技術(shù)為現(xiàn)有藥物開發(fā)出能夠增強(qiáng)其激活效果的藥物運(yùn)輸載體。在癌癥治療中,納米載體運(yùn)送體系相比于許多傳統(tǒng)的藥物運(yùn)送方法,其優(yōu)勢已得到了充分的證實。美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)和其他一些國家已經(jīng)批準(zhǔn)了幾種納米藥物用于腫瘤治療。在本章研究中,我們將納米運(yùn)送技術(shù)應(yīng)用到HIV儲存庫重激活領(lǐng)域。為此我們合成了一種具有細(xì)胞穿膜功效的兩親性多肽(膽固醇-KG2R9多肽),該多肽能在水溶液中自組裝形成穩(wěn)定的納米顆粒,并能夠包裹小分子疏水藥物,如帕比司他。包裹帕比司他的納米粒子(PNP-P)通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,釋放出帕比司他,這將增強(qiáng)HIV潛伏感染細(xì)胞對藥物的攝取。釋放的帕比司他將進(jìn)入細(xì)胞核并作用于HDAC以促進(jìn)潛伏HIV基因的轉(zhuǎn)錄。新產(chǎn)生的艾滋病毒可以被ART殺死,以實現(xiàn)徹底消除艾滋病毒的目標(biāo)。為了驗證上述假說我們進(jìn)行了以下實驗。(1)我們先對設(shè)計的納米材料進(jìn)行表征,利用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察納米粒子的形貌,利用動態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS)測量納米粒子的粒徑與電位,利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)檢測納米材料的包封率、載藥率和體外的釋藥情況,利用DiO染色判斷納米粒子的穩(wěn)定性。通過以上測試,我們成功構(gòu)建了帶有正電荷、穩(wěn)定性好、具有緩釋作用、直徑約為80 nm的球狀納米載體藥物PNP-P。(2)我們通過流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測了細(xì)胞對PNP-P的攝取能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的納米藥物比單獨的帕比司他更容易被HIV潛伏感染的細(xì)胞攝取。提高了細(xì)胞對藥物的攝取能力,有利于增加藥物的激活效率。(3)在評價了PNP-P的細(xì)胞攝取能力后,我們又通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了納米藥物的細(xì)胞毒性。PNP-P處理后的細(xì)胞仍有90%左右的存活率,說明我們的納米藥物細(xì)胞毒性較小。(4)促使組蛋白乙酰化是激活潛伏HIV的關(guān)鍵。我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了經(jīng)過PNP-P處理后細(xì)胞組蛋白乙酰化水平的變化。實驗結(jié)果證明PNP-P能夠增加細(xì)胞的組蛋白乙酰化水平,為其發(fā)揮激活作用提供了理論基礎(chǔ)。(5)在體外,通過三個層次的HIV潛伏感染細(xì)胞模型驗證PNP-P對病毒儲存庫的激活能力。首先,利用假病毒細(xì)胞模型J-Lat Tat-GFP clone A72和J-Lat Tat-GFP clone A82,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測報告基因GFP的表達(dá)情況,證明了PNP-P能夠激活假病毒細(xì)胞模型中HIV的啟動子。然后,利用潛伏感染細(xì)胞模型ACH2和U1/HIV,通過檢測激活標(biāo)志物CD69、HIV衣殼蛋白p24以及細(xì)胞上清中的病毒載量,我們發(fā)現(xiàn),PNP-P具有優(yōu)于單獨使用帕比司他的潛伏HIV激活效果。最后,為了驗證PNP-P的體外激活能力,我們招募了兩名經(jīng)過ART治療的HIV感染者,其血液病毒含量已低于臨床檢測水平。從兩名HIV感染者的血液樣本中分離出外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),給予納米藥物干預(yù),實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)PNP-P能夠增加樣本細(xì)胞上清中的病毒載量。這些結(jié)果證實了我們構(gòu)建的納米遞送體系能夠在體外細(xì)胞水平幫助藥物提高潛伏HIV的激活能力。(6)為了檢測PNP-P對體內(nèi)潛伏HIV的激活能力,我們開展了相關(guān)的動物實驗。將J-Lat Tat-GFP clone A72細(xì)胞注射到聯(lián)合重度免疫缺陷小鼠(M-NSG)體內(nèi),再給予一定劑量的納米藥物干預(yù)。24小時后,從小鼠體內(nèi)分離出J-Lat Tat-GFP clone A72細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測GFP發(fā)光情況。實驗結(jié)果證明了PNP-P能夠在體內(nèi)激活J-Lat Tat-GFP clone A72細(xì)胞并且其激活效率遠(yuǎn)高于單獨帕比司他給藥組。同時我們還對納米藥物的生物安全性進(jìn)行了評價。我們收集了小鼠的血清以及各個臟器進(jìn)行了生化指標(biāo)檢測和組織切片HE染色拍照。分析生化指標(biāo)檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn),PNP-P處理沒有對心臟、肝臟和腎臟的功能產(chǎn)生影響;HE染色結(jié)果也沒有發(fā)現(xiàn)心臟、肝臟、脾臟、肺部以及腎臟出現(xiàn)任何異常,說明了我們構(gòu)建的納米體系沒有毒副作用,具有良好的生物相容性。通過本章的研究,我們證明了PNP-P具有優(yōu)于單獨使用帕比司他的潛伏HIV重激活作用。該研究表明納米技術(shù)可以幫助現(xiàn)有LRA改善潛伏HIV的激活效率,這項研究為進(jìn)一步開發(fā)用于HIV儲存庫重激活的LRA輸送系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。結(jié)論:綜上所述,本文為解決HDACI等LRA激活效率低的問題提供了兩種解決方案,即新的有效藥物和新的給藥策略。本研究證實了西達(dá)本胺作為一種新的LRA對潛伏HIV的激活能力,同時明確了利用納米技術(shù)提高了現(xiàn)有LRA(帕比司他)激活HIV儲存庫的應(yīng)用前景。這些均為實現(xiàn)HIV儲存庫的徹底清除奠定了重要的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R512.91
【部分圖文】：

Figure 1. HIV-1 latent infection.圖 1. HIV 潛伏感染。HIV 潛伏機(jī)制包括：（1）組蛋白去乙酰化酶（HDAC，histone deacetylase）和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histonemethyltransferase，HMT）向 HIV 啟動子長末端重復(fù)序列（longterminalrepeat，LTR）的募集，導(dǎo)致核小體 Nuc-0 和 Nuc-1 區(qū)域的組蛋白去乙�；图谆瑥亩拗妻D(zhuǎn)錄的起始[68,69]; （2）轉(zhuǎn)錄和延長因子的隔離或失活，如核因子 κB（nuclearfactorκB，NF-κB）、活化 T 細(xì)胞核因子（nuclearfactorof activated T cells，NFAT）或真核基因正性轉(zhuǎn)錄延伸因子 b（positive transcriptionelongation factor b，P-TEFb），它們對轉(zhuǎn)錄的啟動或延長很重要[70,71]；（3）其他機(jī)制，如 HIV DNA 甲基化[72]、轉(zhuǎn)錄后阻滯[73]和抑制 HIV 產(chǎn)生的細(xì)胞 microRNA[74]等�！皊hock and kill”治療策略與 LRA研究開發(fā)能夠清除這種潛伏病毒儲存庫的治療辦法已成為 HIV 研究的重中之重。目前針對 HIV 儲存庫的治療策略主要有三種：（1）“永久沉默”，保持 HIV儲存庫永久受到抑制，該策略依賴于減少 T 細(xì)胞的活化，缺點在于需要 HIV 感染

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文倫理道德等問題[75]；（3） “激活再殺滅（shockandkill）”，被很多研究學(xué)者認(rèn)為是目前最有希望被廣泛應(yīng)用于實現(xiàn)徹底清除 HIV 儲存庫的治療策略[76-78]。該方案的特征在于使用藥理學(xué)試劑來逆轉(zhuǎn) HIV 潛伏狀態(tài)并刺激潛伏感染的細(xì)胞表達(dá)病毒蛋白，這將使這些細(xì)胞死于免疫介導(dǎo)的殺傷或病毒介導(dǎo)的細(xì)胞裂解（圖 2[79]）。用于激活潛伏病毒的藥物通常稱為潛伏期逆轉(zhuǎn)劑（latency-reversingagent，LRA），即在潛伏感染細(xì)胞中誘導(dǎo) HIV 產(chǎn)生的化合物。大部分的 LRA 主要在臨床前水平進(jìn)行了研究，但也有少數(shù)藥物在小規(guī)模臨床試驗中進(jìn)行了測試。

Figure 3. Disruption of HIV latency by HDAC inhibitors.圖 3. 組蛋白去乙酰酶抑制劑激活潛伏 HIV。丙戊酸（valproic acid，VPA）是美國食品和藥物管理局（Food and DruAdministration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的抗癲癇藥，可以毫摩爾濃度抑制 I 類和 II 類 HDAC[101]我課題組研究發(fā)現(xiàn) VPA 在失血急救中具有重要作用。VPA 能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝對心臟等重要生命器官起保護(hù)作用，有效地提高大失血動物的存活率，將存活時間從 10 分鐘有效延長至 4 小時，該研究于 2016 年發(fā)表在 scientific reports 雜志上[102]。在 HIV 儲存庫重激活領(lǐng)域一項初步的臨床研究中，4 名接受 ART 治療的
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本文編號：2843269