目的：染色體易位是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)最常見的細胞遺傳學異常。t(8;21)(q22;q22)是AML中最常見的染色體易位,易位形成的AML1-ETO融合基因是t(8；21)AML的顯著特征和始發(fā)因素,同時,存在其他的事件協(xié)同引起AML的發(fā)生。研究證實,AML1-ETO的選擇性剪切體AML1-ETO9a與此類白血病的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關,但AML1-ETO9a產生的調控機制目前尚不清楚。材料與方法：1、收集21例AML1-ETO陽性配對樣本(同一患者不同病程的樣本,包含初治或者復發(fā)的樣本以及緩解的樣本),2例AML1-ETO陰性(也屬于AML-M2患者)配對樣本,進行外顯子高通量測序分析體細胞突變數；對23例樣本的突變基因重現性分析；2、從大量AML臨床樣本和正常人骨髓表達芯片數據庫中,分析不同染色體核型樣本中,富含絲氨酸／精氨酸剪接因子(serine/arginine-rich splicing factor, SRSF)總體上的表達水平;分析22例AML1-ETO陽性、22例AML1-ETO陰性和5例正常人骨髓中表達芯片數據庫,找出在AML1-ETO陽性樣本中異常高表達的剪切因子SRSF2、SRSF6和SRSF11;克隆ETO9a外顯子及其側翼序列,體外轉錄,RNA沉淀(RIP),質譜分析,對所得到的145個差異且有意義的蛋白進行信號途徑分析;Western blot對RIP及質譜結果進行驗證;3、構建SRSF2的慢病毒表達載體,轉染細胞株,克隆形成實驗及細胞增殖實驗,證實SRSF2對選擇性剪切體AML1-ET09a產生的影響,以及對AML1-ETO陽性和陰性的細胞增殖及惡性表型的影響;4、生物信息學分析及熒光素酶驗證AML1-ET09a是miR-9-1的靶基因；熒光定量PCR檢測miR-9-1在細胞系和臨床樣本中的表達。結果：1、外顯子高通量測序結果表明：23例樣本,每個初治或者復發(fā)樣本的體細胞平均突變位點數目為18.6個,突變基因重現性統(tǒng)計,分析可能存在的共性基因突變,其中重現性最高的基因是c-KIT,其重現性為17.4%(4/23),其次為NRAS占13%(3/23), FLT3、NOTCH1、PHF6各占8.7%(2/23)�？偨Y蘇州大學和我們的臨床樣本分析數據以及美國UCSD張東爾教授的結果發(fā)現,AML1-ETO9a在AML1-ETO陽性的臨床樣本中所占得比例分別為100%(44/44)、100%(10/10)和95%(35/37),均遠高于c-KIT突變。2、在t(8;21)AML中,SRSF總體上的表達明顯比其它各型染色體異常AML臨床樣本中高,進一步研究發(fā)現,SRSF2、SRSF6、SRSF11這三個剪切因子在AML1-ETO陽性的AML中異常高表達。3、用ETO9a外顯子及其側翼序列進行的RIP及質譜分析,對有差異的145個有意義的蛋白進行信號途徑分析發(fā)現,超過82%(119/145)的蛋白與核mRNA的剪切、加工、剪切復合體的裝配、調控密切相關,其它的18%(26/145)蛋白則負責調控細胞的凋亡和死亡。SRSF2的慢病毒轉染AML1-ETO陽性的細胞株Kasumi-1和SKNO-1,定量PCR檢測AML1-ETO和AML1-ETO9a的表達,發(fā)現在這兩種細胞系中AML1-ETO9a的表達量顯著提高,分別從13%和7.5%提高到54.2%和50.6%,證實SRSF2可以導致AML1-ETO9a選擇性剪切體的產生,克隆形成實驗及細胞增殖實驗證實,SRSF2可特異性地調控AML1-ETO融合基因陽性細胞的惡性增殖,而對AML1-ETO陰性的細胞系如HL-60則沒有影響。4、生物信息學分析、熒光素酶報道載體及Western blot證實,AML1、AML1-ETO、AML1-ET09a都是miR-9-1的靶基因,而實時熒光定量PCR證實miR-9-1在t(8;21)AML表達明顯降低。結論：1、從遺傳學、基因結構、基因功能及重現性上來說,AML1-ET09a是t(8;21)AML一個更為普遍的“第二次打擊”；2、在轉錄／剪切水平上,剪切因子SRSF2促進了AML1-ET09a的選擇性剪切,并且特異性地促進了AML1-ETO陽性細胞的惡性增殖;3、翻譯水平上,AML1-ET09a是miR-9-1的一個靶基因,miR-9-1可以抑制AML1-ET09a的蛋白翻譯,而miR-9-1在t(8;21)AML中表達明顯降低,從而導致AML1-ET09a大量翻譯出蛋白,導致t(8;21)AML的發(fā)生。目的：侵襲性真菌病(invasive fungal disease, IFD)在惡性血液病患者中發(fā)病率和死亡率均很高,有IFD病史的患者在進一步的化療或造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)中,IFD復燃率高,預后差。二級預防(secondary antifungal prophylaxis, SAP)可有效地預防IFD復燃。本研究旨在探討有IFD病史的惡性血液病患者接受進一步的化療或HSCT時進行SAP的策略和療效,分析SAP失敗的危險因素。材料與方法：我們回顧性分析了2008年1月至2013年6月就診于我院血液科接受化療或HSCT且既往有IFD病史的惡性血液病患者的病歷資料,分析患者的臨床特點和IFD的診斷標準,探討不同SAP策略的療效以及影響IFD復燃的危險因素。結果：入組164例患者,中位隨訪180天,40例出現IFD復燃,其中121例(73.78%,121/164)進行SAP的患者復燃20例,復燃率為16.5%(20/121),43例未進行SAP的患者復燃20例,復燃率為46.5%(20/43),兩組復燃率比較有顯著性差異(p=0.000)。121例進行SAP的患者,其中58例選用既往抗真菌治療有效的藥物進行SAP,8例IFD復燃,復燃率13.8%(8/58),63例換用其他廣譜抗真菌藥物進行SAP,12例IFD復燃,復燃率19.0%(12/63),兩組復燃率比較無顯著性差異(P=0.437)。異基因HSCT患者IFD復燃率(25%,15/60)明顯高于化療或自體HSCT患者(8.2%,5/61)(P=0.013)。多因素分析二級預防下IFD復燃的危險因素顯示異基因HSCT為影響IFD復燃的獨立危險因素。結論：對既往有IFD病史的惡性血液病患者予SAP可有效地防止IFD復燃,異基因HSCT患者的SAP更應重視。
【學位單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R733.7;R519

【參考文獻】

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1 李艷;于力;;造血干細胞移植后侵襲性真菌感染的現狀與未來[J];中國實驗血液學雜志;2011年02期

2 李艷;高麗;王莉莉;丁一;徐媛媛;李紅華;靖_g;薄劍;黃文榮;王全順;高春記;于力;;異基因移植患者RQ-PCR監(jiān)測巨細胞病毒感染并指導搶先治療的臨床研究(英文)[J];中國實驗血液學雜志;2013年01期

本文編號：2822447