本文關鍵詞：HSP90抑制劑對白念珠菌刺激巨噬細胞分泌IL-23的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:白念珠菌是引起人類真菌感染的主要致病菌,在醫(yī)院獲得性感染中居第四位,死亡率接近50%,它常寄生在人類的口腔、下呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道中,可引起口腔泌尿生殖道等的表淺感染,也可通過血行播散和器官入侵引起免疫力低下病人致命的系統(tǒng)性感染,患者出現(xiàn)念珠菌血癥、心內(nèi)膜炎,中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、眼內(nèi)炎和骨髓炎,造成多器官功能的損害甚至死亡。在系統(tǒng)性白念珠菌感染過程中,強烈的炎癥反應不僅對機體沒有有利作用,反而對機體器官組織造成損傷。IL-23參與機體防御白念珠菌感染的天然免疫過程,IL-23產(chǎn)生后可刺激巨噬細胞產(chǎn)生更多的促炎因子,并可作用于Th17細胞,激活獲得性免疫反應,進一步增強機體清除白念珠菌的能力,IL-23對Th17細胞的生存、增殖、再激活及產(chǎn)生IL-17是不可缺少的。因此,IL-23是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。Hsp90是一個進化保守、含量十分豐富的分子伴侶,不僅參與應激反應,還參與了炎癥反應和天然免疫反應過程,它影響著大量客戶蛋白的活性和信號通路的傳導。本實驗通過巨噬細胞與白念珠菌體外相互作用,探討巨噬細胞與白念珠菌體外相互作用后IL-23的表達分泌水平及Hsp90抑制劑對IL-23表達分泌水平的影響。方法:1實驗用小鼠昆明種健康小鼠30只,雌性,清潔級,4-5周齡,15~20g,由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供,合格證編號:1404078。2實驗用菌株白念珠菌標準株ATCC 90028購于中國醫(yī)學科學院微生物研究所。3菌株的活化和菌懸液的配制白念珠菌標準株復溫后在沙氏培養(yǎng)基上活化三次,加入含0.1%吐溫80的1640培養(yǎng)液,吸管吹打混勻,用血球計數(shù)板計數(shù),調(diào)整終濃度至1-2×106/m L。4巨噬細胞分離培養(yǎng)及鑒定小鼠腹腔巨噬細胞分離法提取巨噬細胞,顯微鏡下計數(shù),并用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng),巨噬細胞培養(yǎng)3天后取出。巨噬細胞的鑒定采用形態(tài)學及免疫組化SP法:取出的巨噬細胞PBS洗滌3遍,丙酮固定,常規(guī)HE染色、瑞士-吉姆薩染色及免疫組織化學SP法檢測巨噬細胞CD68抗原的表達,中性樹膠封固。5實驗分組與處理實驗分為實驗組和對照組。巨噬細胞培養(yǎng)3天后取出,離心洗滌后計數(shù)板計數(shù)。用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液調(diào)整終濃度至5-6×105/m L,轉(zhuǎn)種至6孔板中,每孔2 ml,培養(yǎng)24小時后每孔加入濃度為1×106/m L菌懸液0.5 ml。實驗組每孔分別加入0.01mmol/L~0.5mmol/L濃度的17-DMAG100mL,對照組加入同體積含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液。0.1mmol/L濃度實驗組及對照組分別于實驗的第2、4、6、12小時收集細胞及上清液。不同濃度17-DMAG實驗組于第4小時收集上清液。上清液-80℃凍存待測。各孔分別設3個平行孔。6流式細胞術檢測IL-23的表達水平實驗各組巨噬細胞從六孔板吹打下來后離心,PBS洗滌2遍,加入0.1%Triton X-100打孔,避光孵育20分鐘,IL-23抗體染色,避光孵育15分鐘,流式細胞儀檢測巨噬細胞內(nèi)IL-23的表達水平,用FACSDiva Software軟件分析數(shù)據(jù)。7 ELISA法檢測IL-23的分泌水平實驗各組收集的上清液復溫,按試劑盒說明操作,檢測細胞培養(yǎng)液中IL-23在蛋白水平的表達。結(jié)果:1巨噬細胞培養(yǎng)形態(tài)觀察培養(yǎng)第一天倒置顯微鏡下可見巨噬細胞為圓形和橢圓形,貼壁生長。培養(yǎng)第三天,顯微鏡下可見巨噬細胞體積略增大,為圓形,橢圓形,多角形,多數(shù)有偽足和凸起,貼壁生長。2巨噬細胞HE染色和瑞士-吉姆薩染色結(jié)果HE染色顯微鏡下可見巨噬細胞胞漿豐富,呈粉紅色,核大深藍色,瑞士染色顯微鏡下可見胞質(zhì)淡藍色,細胞核紫紅色。兩種染色均可見細胞核呈腎形,馬蹄形,偏居于一側(cè)。3巨噬細胞免疫組織化學結(jié)果CD68陽性反應定位于培養(yǎng)巨噬細胞的胞膜及胞漿。4流式細胞術檢測巨噬細胞內(nèi)IL-23表達水平結(jié)果在實驗的2h、4h、6h及12h,實驗組IL-23表達水平分別為6.24±1.16,8.09±1.15,10.54±0.67及3.69±0.21。對照組IL-23表達水平分別為8.19±1.01,10.06±0.32,12.10±1.97及4.76±0.86。實驗組和對照組IL-23的表達水平均隨著作用時間的延長先上升后下降,并在第6小時表達水平達高峰期。實驗組表達水平明顯低于對照組,F=55.643 P=0.000P0.05,差異有統(tǒng)計學意義。5上清液中IL-23分泌水平檢測結(jié)果。在實驗的2h、4h、6h及12h,實驗組IL-23表達水平(pg/m L)分別為225.17±7.95,243.60±5.81,257.61±12.48及259.19±7.92。對照組268.99±14.34,278.62±14.54,295.96±5.65及309.79±4.34。實驗組和對照組IL-23的分泌水平均隨著作用時間的延長不斷升高,第6小時后增長速度明顯減慢。實驗組分泌水平明顯低于對照組,F=17.41P=0.000 P0.05,差異有統(tǒng)計學意義。6不同濃度HSP90抑制劑17-DMAG對上清液中IL-23分泌水平的影響。0.01mmol/L,0.1mmol/L,0.25mmol/L及0.5mmol/L濃度17-DMAG實驗組上清液IL-23分泌水平(pg/m L)分別為261.21±2.02,254.09±1.92,248.69±1.30,234.41±3.81,隨抑制劑濃度升高,IL-23分泌水平相應降低。F=64.43 P=0.000 P0.05,差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論:1白念珠菌與小鼠腹腔巨噬細胞體外相互作用,隨著作用時間的延長,IL-23表達水平先上升后下降。2白念珠菌與小鼠腹腔巨噬細胞體外相互作用,加入HSP90抑制劑后,IL-23表達及分泌水平明顯下降。3 HSP90抑制劑對白念珠菌刺激小鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-23的表達及分泌水平的影響呈濃度及時間依賴性。綜上結(jié)果表明,白念珠菌與小鼠腹腔巨噬細胞體外相互作用,加入HSP90抑制劑后,IL-23表達水平明顯下降,并呈時間及濃度依賴性。HSP90抑制劑可能通過降低IL-23的分泌和表達,減少其對組織的損傷,從而對機體起保護作用。
【關鍵詞】：HSP90抑制劑 17-DMAG 白念珠菌 巨噬細胞 IL-23
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R519
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-20
• 結(jié)果20-22
• 附圖22-27
• 附表27-28
• 討論28-33
• 結(jié)論33
• 參考文獻33-39
• 綜述39-47
• 參考文獻44-47
• 致謝47-48
• 個人簡歷48

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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  本文關鍵詞：HSP90抑制劑對白念珠菌刺激巨噬細胞分泌IL-23的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：282133