發(fā)布時(shí)間：2017-04-02 08:05

  本文關(guān)鍵詞：HSP90抑制劑對(duì)白念珠菌刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-23的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:白念珠菌是引起人類(lèi)真菌感染的主要致病菌,在醫(yī)院獲得性感染中居第四位,死亡率接近50%,它常寄生在人類(lèi)的口腔、下呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道中,可引起口腔泌尿生殖道等的表淺感染,也可通過(guò)血行播散和器官入侵引起免疫力低下病人致命的系統(tǒng)性感染,患者出現(xiàn)念珠菌血癥、心內(nèi)膜炎,中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、眼內(nèi)炎和骨髓炎,造成多器官功能的損害甚至死亡。在系統(tǒng)性白念珠菌感染過(guò)程中,強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)不僅對(duì)機(jī)體沒(méi)有有利作用,反而對(duì)機(jī)體器官組織造成損傷。IL-23參與機(jī)體防御白念珠菌感染的天然免疫過(guò)程,IL-23產(chǎn)生后可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的促炎因子,并可作用于Th17細(xì)胞,激活獲得性免疫反應(yīng),進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體清除白念珠菌的能力,IL-23對(duì)Th17細(xì)胞的生存、增殖、再激活及產(chǎn)生IL-17是不可缺少的。因此,IL-23是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。Hsp90是一個(gè)進(jìn)化保守、含量十分豐富的分子伴侶,不僅參與應(yīng)激反應(yīng),還參與了炎癥反應(yīng)和天然免疫反應(yīng)過(guò)程,它影響著大量客戶(hù)蛋白的活性和信號(hào)通路的傳導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)巨噬細(xì)胞與白念珠菌體外相互作用,探討巨噬細(xì)胞與白念珠菌體外相互作用后IL-23的表達(dá)分泌水平及Hsp90抑制劑對(duì)IL-23表達(dá)分泌水平的影響。方法:1實(shí)驗(yàn)用小鼠昆明種健康小鼠30只,雌性,清潔級(jí),4-5周齡,15~20g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證編號(hào):1404078。2實(shí)驗(yàn)用菌株白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 90028購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物研究所。3菌株的活化和菌懸液的配制白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株復(fù)溫后在沙氏培養(yǎng)基上活化三次,加入含0.1%吐溫80的1640培養(yǎng)液,吸管吹打混勻,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)整終濃度至1-2×106/m L。4巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離法提取巨噬細(xì)胞,顯微鏡下計(jì)數(shù),并用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),巨噬細(xì)胞培養(yǎng)3天后取出。巨噬細(xì)胞的鑒定采用形態(tài)學(xué)及免疫組化SP法:取出的巨噬細(xì)胞PBS洗滌3遍,丙酮固定,常規(guī)HE染色、瑞士-吉姆薩染色及免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)巨噬細(xì)胞CD68抗原的表達(dá),中性樹(shù)膠封固。5實(shí)驗(yàn)分組與處理實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。巨噬細(xì)胞培養(yǎng)3天后取出,離心洗滌后計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液調(diào)整終濃度至5-6×105/m L,轉(zhuǎn)種至6孔板中,每孔2 ml,培養(yǎng)24小時(shí)后每孔加入濃度為1×106/m L菌懸液0.5 ml。實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入0.01mmol/L~0.5mmol/L濃度的17-DMAG100mL,對(duì)照組加入同體積含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液。0.1mmol/L濃度實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組分別于實(shí)驗(yàn)的第2、4、6、12小時(shí)收集細(xì)胞及上清液。不同濃度17-DMAG實(shí)驗(yàn)組于第4小時(shí)收集上清液。上清液-80℃凍存待測(cè)。各孔分別設(shè)3個(gè)平行孔。6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-23的表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)各組巨噬細(xì)胞從六孔板吹打下來(lái)后離心,PBS洗滌2遍,加入0.1%Triton X-100打孔,避光孵育20分鐘,IL-23抗體染色,避光孵育15分鐘,流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-23的表達(dá)水平,用FACSDiva Software軟件分析數(shù)據(jù)。7 ELISA法檢測(cè)IL-23的分泌水平實(shí)驗(yàn)各組收集的上清液復(fù)溫,按試劑盒說(shuō)明操作,檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-23在蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果:1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)觀察培養(yǎng)第一天倒置顯微鏡下可見(jiàn)巨噬細(xì)胞為圓形和橢圓形,貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)第三天,顯微鏡下可見(jiàn)巨噬細(xì)胞體積略增大,為圓形,橢圓形,多角形,多數(shù)有偽足和凸起,貼壁生長(zhǎng)。2巨噬細(xì)胞HE染色和瑞士-吉姆薩染色結(jié)果HE染色顯微鏡下可見(jiàn)巨噬細(xì)胞胞漿豐富,呈粉紅色,核大深藍(lán)色,瑞士染色顯微鏡下可見(jiàn)胞質(zhì)淡藍(lán)色,細(xì)胞核紫紅色。兩種染色均可見(jiàn)細(xì)胞核呈腎形,馬蹄形,偏居于一側(cè)。3巨噬細(xì)胞免疫組織化學(xué)結(jié)果CD68陽(yáng)性反應(yīng)定位于培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的胞膜及胞漿。4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-23表達(dá)水平結(jié)果在實(shí)驗(yàn)的2h、4h、6h及12h,實(shí)驗(yàn)組IL-23表達(dá)水平分別為6.24±1.16,8.09±1.15,10.54±0.67及3.69±0.21。對(duì)照組IL-23表達(dá)水平分別為8.19±1.01,10.06±0.32,12.10±1.97及4.76±0.86。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組IL-23的表達(dá)水平均隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后下降,并在第6小時(shí)表達(dá)水平達(dá)高峰期。實(shí)驗(yàn)組表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組,F=55.643 P=0.000P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5上清液中IL-23分泌水平檢測(cè)結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)的2h、4h、6h及12h,實(shí)驗(yàn)組IL-23表達(dá)水平(pg/m L)分別為225.17±7.95,243.60±5.81,257.61±12.48及259.19±7.92。對(duì)照組268.99±14.34,278.62±14.54,295.96±5.65及309.79±4.34。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組IL-23的分泌水平均隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高,第6小時(shí)后增長(zhǎng)速度明顯減慢。實(shí)驗(yàn)組分泌水平明顯低于對(duì)照組,F=17.41P=0.000 P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6不同濃度HSP90抑制劑17-DMAG對(duì)上清液中IL-23分泌水平的影響。0.01mmol/L,0.1mmol/L,0.25mmol/L及0.5mmol/L濃度17-DMAG實(shí)驗(yàn)組上清液IL-23分泌水平(pg/m L)分別為261.21±2.02,254.09±1.92,248.69±1.30,234.41±3.81,隨抑制劑濃度升高,IL-23分泌水平相應(yīng)降低。F=64.43 P=0.000 P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1白念珠菌與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外相互作用,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),IL-23表達(dá)水平先上升后下降。2白念珠菌與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外相互作用,加入HSP90抑制劑后,IL-23表達(dá)及分泌水平明顯下降。3 HSP90抑制劑對(duì)白念珠菌刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-23的表達(dá)及分泌水平的影響呈濃度及時(shí)間依賴(lài)性。綜上結(jié)果表明,白念珠菌與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外相互作用,加入HSP90抑制劑后,IL-23表達(dá)水平明顯下降,并呈時(shí)間及濃度依賴(lài)性。HSP90抑制劑可能通過(guò)降低IL-23的分泌和表達(dá),減少其對(duì)組織的損傷,從而對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：HSP90抑制劑 17-DMAG 白念珠菌 巨噬細(xì)胞 IL-23
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R519
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-20
• 結(jié)果20-22
• 附圖22-27
• 附表27-28
• 討論28-33
• 結(jié)論33
• 參考文獻(xiàn)33-39
• 綜述39-47
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 致謝47-48
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷48

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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  本文關(guān)鍵詞：HSP90抑制劑對(duì)白念珠菌刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-23的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：282133