【摘要】：研究背景過去40余年,隨著免疫缺陷人群的逐年增加,毛孢子菌屬已成為引起臨床深部真菌感染的重要條件致病菌。侵襲性毛孢子菌病是一種相對少見的致死性、機會性深部真菌感染性疾病,由于不能及時診斷,又缺乏全面、有效的治療方案,死亡率高居不下(53%-76%)。毛孢子菌菌血癥(包括:導(dǎo)管相關(guān)菌血癥)是最主要感染類型,占到侵襲性毛孢子菌病的58.8-74.7%;毛孢子菌屬已成為血液系統(tǒng)腫瘤患者真菌菌血癥排名第二的常見病原酵母菌。2014年歐洲制定的《少見侵襲性酵母菌感染診療指南》是目前全球唯一涉及毛孢子菌病的診療指南(正文共15頁,但涉及毛孢子菌病僅2頁),但由于該病發(fā)病率較低,導(dǎo)致上述指南和建議僅是基于體外藥敏實驗、動物實驗、病例報道或樣本量較小的病例分析,而非多中心、大樣本、臨床對照研究來源的數(shù)據(jù)支撐;因此,指南建議的循證醫(yī)學(xué)等級較低,且對于疾病預(yù)后的評判以及其他相關(guān)重要問題并無針對性具體方案,特別是毛孢子菌導(dǎo)管相關(guān)菌血癥的導(dǎo)管管理仍無針對性具體建議。此外,近年來毛孢子菌屬對氟康唑敏感性有下降趨勢。目前,針對毛孢子菌菌血癥只有伏立康唑和氟康唑被推薦臨床應(yīng)用,一旦出現(xiàn)氟康唑耐藥而伏立康唑又不能獲取(經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)),必然會影響患者的臨床預(yù)后。因此,由于現(xiàn)存上述多種相關(guān)臨床問題,目前制定綜合、有效的毛孢子菌菌血癥治療方案仍較困難。研究目的由于發(fā)病率較低,自1975年首次報道至今,毛孢子菌菌血癥仍無大樣本、系統(tǒng)性的回顧分析和臨床對照研究。通過對本院電子病歷系統(tǒng)及PubMed數(shù)據(jù)庫40年時間段病例的整理,初步揭示其全球流行病學(xué)趨勢,并對預(yù)后因素和臨床治療策略與患者臨床結(jié)局的關(guān)系進行統(tǒng)計學(xué)分析,從而指導(dǎo)臨床預(yù)后的評判和綜合治療方案的制定。其次,通過對阿薩希毛孢子菌臨床株生物膜狀態(tài)和游離狀態(tài)的體外聯(lián)合藥敏實驗,為導(dǎo)管相關(guān)菌血癥封管治療中抗真菌藥物的選擇提供實驗室依據(jù)。最后,通過體外、體內(nèi)誘導(dǎo)實驗和臨床病例分析的方法,探討鈣調(diào)磷酸酶抑制劑對于阿薩希毛孢子菌氟康唑獲得性耐藥的影響�；谏鲜雠R床與基礎(chǔ)研究結(jié)果,為臨床一線醫(yī)生制定更全面的毛孢子菌菌血癥治療方案提供建議和依據(jù)。研究方法和結(jié)果第一部分毛孢子菌菌血癥預(yù)后因素分析與治療策略的臨床研究基于本院電子病歷數(shù)據(jù)系統(tǒng)及對PubMed數(shù)據(jù)庫(1975年至2014年)納入185例毛孢子菌菌血癥患者,收集重要臨床信息并分類統(tǒng)計,并對預(yù)后因素和臨床治療方案與患者終末結(jié)局之間進行統(tǒng)計學(xué)分析。全球報道病例的數(shù)量逐年增加;病例前30年主要分布于北美洲和歐洲,后10年主要在亞洲和南美洲�；颊咂骄挲g47歲,但后10年成年人比例有所下降,新生兒、兒童及老年人的比例上升;受累人群始終以男性為主。血液系統(tǒng)疾病是最常見基礎(chǔ)病,其中急性白血病占比最高;但后10年急性白血病的比例下降,例如糖尿病、早產(chǎn)及實體腫瘤等其他基礎(chǔ)病患者的比例上升。多數(shù)患者發(fā)病前或發(fā)病時,有中性粒細(xì)胞減少癥、化療、中心靜脈置管、抗生素使用或預(yù)防性/經(jīng)驗性抗真菌治療的病史。59.46%的患者伴有單個深部組織器官或播散性感染,最常累及的部位是肺臟、皮膚、肝臟、腎臟和脾臟。形態(tài)學(xué)方法結(jié)合生化試驗(45.41%)是最常用的臨床鑒定方法,后10年更多使用分子學(xué)鑒定方法。阿薩希毛孢子菌是最常見的毛孢子菌臨床分離株(75%)。109例患者出現(xiàn)了負(fù)面結(jié)局(死亡/病情加重),76例患者則是正面結(jié)局(治愈/病情改善);后10年患者預(yù)后較前30年改善不明顯。單因素分析時,使用抗細(xì)菌藥物、預(yù)防性/經(jīng)驗性抗真菌治療、伴有細(xì)菌菌血癥以及未進行菌種鑒定與臨床負(fù)面結(jié)局相關(guān);此外,單純真菌血癥(不伴有侵襲性組織/器官感染)、感染后拔除中心靜脈置管以及外周血粒細(xì)胞水平恢復(fù)正常與臨床正面結(jié)局相關(guān)。前30年,兩性霉素B/兩性霉素B脂質(zhì)體是最常用的抗真菌治療方案;而后10年,唑類抗真菌藥成為最常用的治療方案。盡管唑類抗真菌藥廣泛應(yīng)用,但患者的整體預(yù)后改善不明顯。對抗真菌治療方案的分析發(fā)現(xiàn):使用伏立康唑或唑類抗真菌藥聯(lián)合兩性霉素B治療與患者正面結(jié)局相關(guān);然而,使用兩性霉素B治療與患者負(fù)面結(jié)局相關(guān)。不同治療方案組間兩兩比較發(fā)現(xiàn):伏立康唑與兩性霉素B、氟康唑與兩性霉素B、唑類抗真菌藥聯(lián)合兩性霉素B與兩性霉素B的臨床結(jié)局差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;而其他抗真菌治療方案之間臨床結(jié)局的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。第二部分阿薩希毛孢子菌臨床株(生物膜/游離狀態(tài))體外聯(lián)合藥敏研究參照CLSI制訂的病原酵母菌標(biāo)準(zhǔn)化方案M27-A3,結(jié)合棋盤微量肉湯稀釋法對16株阿薩希毛孢子菌臨床分離株的游離狀態(tài),進行三種常用抗真菌藥(伏立康唑、兩性霉素B和卡泊芬凈)的體外聯(lián)合藥敏實驗;基于96孔板構(gòu)建阿薩希毛孢子菌生物膜,并結(jié)合棋盤法進行生物膜體外聯(lián)合藥敏實驗。游離狀態(tài)時,兩性霉素B聯(lián)合卡泊芬凈顯示出最高比例的協(xié)同效應(yīng)(81.25%)。生物膜狀態(tài)時,伏立康唑聯(lián)合兩性霉素B顯示出最高比例的協(xié)同效應(yīng)(87.5%);伏立康唑SMIC90從?1,024μg/mL下降至64μg/mL,兩性霉素B SMIC90從1024μg/mL下降至32μg/mL。第三部分鈣調(diào)磷酸酶抑制劑對阿薩希毛孢子菌氟康唑獲得性耐藥的影響阿薩希毛孢子菌標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479分別進行氟康唑梯度濃度聯(lián)合鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(環(huán)孢素A)固定濃度、氟康唑梯度濃度以及環(huán)孢素A固定濃度誘導(dǎo),同時設(shè)置空白對照組;誘導(dǎo)階段每代及誘導(dǎo)終點檢測誘導(dǎo)株對氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的敏感性。經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng),氟康唑梯度濃度聯(lián)合環(huán)孢素A固定濃度誘導(dǎo)獲得的耐藥株,氟康唑MIC值上升了8-16倍,伊曲康唑MIC值上升了4-8倍,伏立康唑MIC值上升了2倍;氟康唑梯度濃度誘導(dǎo)獲得的耐藥株,氟康唑MIC值上升了32倍,伊曲康唑MIC值上升了8-16倍,伏立康唑MIC值上升了2-4倍。耐藥株在無藥培養(yǎng)基中進行連續(xù)傳代后發(fā)現(xiàn),隨著傳代次數(shù)的增多,聯(lián)合組耐藥株對氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑MIC值恢復(fù)或接近初始狀態(tài);而氟康唑單藥組耐藥株的耐藥表型穩(wěn)定。使用環(huán)磷酰胺對實驗小鼠進行定期免疫抑制,制備標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479菌懸液進行鼠尾靜脈接種,從而構(gòu)建氟康唑干預(yù)下的阿薩希毛孢子菌持續(xù)感染模型。分組進行腹腔內(nèi)藥物注射:氟康唑聯(lián)合環(huán)孢素A、氟康唑、環(huán)孢素A和空白對照;記錄小鼠生存情況,取心臟、肺臟、肝臟及腎臟進行培養(yǎng)和組織病理檢測(HE及亮綠染色)并對分離菌株檢測氟康唑敏感性。經(jīng)過氟康唑體內(nèi)干預(yù),氟康唑單藥組中90%分離株的氟康唑MIC值出現(xiàn)不同程度升高(2-4倍),而氟康唑聯(lián)合環(huán)孢素A中僅有60%分離株的氟康唑MIC值上升2倍。對體內(nèi)誘導(dǎo)獲得的MIC值升高菌株進行免疫抑制小鼠接種并檢測氟康唑敏感性。氟康唑聯(lián)合環(huán)孢素A組菌株體內(nèi)傳代后最終氟康唑MIC值基本恢復(fù)初始狀態(tài),而氟康唑單藥組菌株基本穩(wěn)定。病例來源同第一部分,對明確診斷為血液系統(tǒng)疾病且接受骨髓移植后出現(xiàn)毛孢子菌菌血癥的病例資料進行匯總分析,獲得19例患者,14例未接受氟康唑或伏立康唑抗真菌治療的患者全部死亡。接受氟康唑或伏立康唑抗真菌長周期治療的5例患者中,4例患者的抗排異治療方案中使用了鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(3例使用環(huán)孢素A、1例使用他克莫司),上述4例患者都最終痊愈;而使用環(huán)磷酰胺聯(lián)合氟達拉濱作為抗排異治療方案的患者死亡。研究結(jié)論第一部分病例一患者持續(xù)接受大劑量的糖皮質(zhì)激素治療,且同時存在其他危險因素導(dǎo)致繼發(fā)毛孢子菌菌血癥。由于接受卡泊芬凈經(jīng)驗性抗真菌治療藥物,而伏立康唑應(yīng)用不及時;且對于導(dǎo)管管理未給予針對性措施,最終預(yù)后不良。這提示目前毛孢子菌菌血癥的臨床治療仍存在大量有待解決的問題,包括:患者預(yù)后的評估、治療藥物的選擇和導(dǎo)管管理的具體措施仍有待解決。病例二患者由于存在的特殊遺傳背景,14年間病情不斷反復(fù)、不規(guī)范服用唑類藥物,菌株出現(xiàn)對氟康唑耐藥,提示對于需要長期使用唑類藥物治療的毛孢子菌病患者,需要制定更為全面、科學(xué)的治療策略,從而避免或減少誘導(dǎo)耐藥的發(fā)生。自1975年首次報道以來,全球毛孢子菌菌血癥病例的數(shù)量逐年增加;報道從北美洲和歐洲逐漸擴展至亞洲和南美洲,累及人群從成年人擴展至新生兒、兒童和老年人。血液系統(tǒng)惡性腫瘤仍是最常見基礎(chǔ)病,但其他更多類型的基礎(chǔ)病占比上升;低中性粒細(xì)胞血癥、中心靜脈置管、抗生素使用、化療以及預(yù)防性/經(jīng)驗性抗真菌治療是患者發(fā)生毛孢子菌菌血癥的主要危險因素,但近年來患者的基礎(chǔ)狀態(tài)更為復(fù)雜,對臨床診療工作提出更多挑戰(zhàn)。盡管在近年來唑類抗真菌藥廣泛應(yīng)用,但患者的整體預(yù)后改善不明顯。使用抗生素、預(yù)防性/經(jīng)驗性抗真菌治療、中心靜脈置管未拔除、伴有細(xì)菌菌血癥或侵襲性組織/器官感染,以及未進行菌種鑒定時,毛孢子菌菌血癥患者預(yù)后不良。伏立康唑可有效改善患者預(yù)后;如果臨床無法獲取伏立康唑,可考慮使用氟康唑聯(lián)合兩性霉素B的治療方案,患者病情穩(wěn)定后氟康唑單藥治療。如果伴有持續(xù)低中性粒細(xì)胞血癥,建議調(diào)整免疫抑制劑治療方案,配合給予粒細(xì)胞集落刺激因子或粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子,促進患者外周血粒細(xì)胞水平的恢復(fù)。此外,對于導(dǎo)管相關(guān)毛孢子菌菌血癥,建議在臨床條件允許的情況下拔除中心靜脈置管,從而改善患者預(yù)后。第二部分第一部分的臨床研究發(fā)現(xiàn),毛孢子菌菌血癥患者較大比例為導(dǎo)管相關(guān)菌血癥,該類感染屬于生物膜相關(guān)感染;前一部分的研究結(jié)果也證實拔除導(dǎo)管可改善患者預(yù)后。但如果患者現(xiàn)有導(dǎo)管無法拔除時,需要考慮進行封管治療。本部分的研究證實,所有抗真菌藥單藥對毛孢子菌生物膜的抑制活性都不強(單藥SMIC高于既往封管液推薦濃度),所以不推薦單獨作為封管液用于阿薩希毛孢子菌導(dǎo)管相關(guān)菌血癥的封管治療;而伏立康唑聯(lián)合兩性霉素B的協(xié)同效應(yīng)最好,聯(lián)合后兩種藥物的SMIC均出現(xiàn)顯著降低(達到封管液推薦藥物濃度)。因此,該組合是導(dǎo)管相關(guān)阿薩希毛孢子菌菌血癥封管液的最佳選擇,特別是對于那些依賴留置導(dǎo)管或拔除導(dǎo)管風(fēng)險較大的重癥患者(例如我院的病例一)。第三部分第一部分回顧性研究發(fā)現(xiàn),氟康唑是唑類藥物中最常用的治療選擇;本部分體外及動物體內(nèi)實驗研究證實,鈣調(diào)磷酸酶在阿薩希毛孢子菌對氟康唑的獲得性耐藥中發(fā)揮了一定作用,應(yīng)用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑可部分阻斷獲得性耐藥的發(fā)生,且即使出現(xiàn)耐藥,該表型在脫離藥物應(yīng)激壓力后可出現(xiàn)轉(zhuǎn)復(fù)。同時,臨床相關(guān)系列病例分析發(fā)現(xiàn),對于特定人群具有鈣調(diào)磷酸酶抑制劑臨床直接應(yīng)用需求。因此,建議對于骨髓移植后同時需要接受抗排異治療的患者可以考慮選擇鈣調(diào)磷酸酶抑制劑作為抗排異方案配合氟康唑使用;而對于其他需要長期接受氟康唑治療的阿薩希毛孢子菌感染患者(例如本院的病例二),還需要進一步篩選出病原真菌特異性的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑進行臨床應(yīng)用,從而減少氟康唑長期應(yīng)用出現(xiàn)臨床耐藥。全文總結(jié)作為一名專業(yè)型博士研究生,從臨床問題出發(fā),以解決臨床現(xiàn)實問題為目的�；趯Ρ驹翰±辉\療工作的深入分析,針對現(xiàn)有指南存在的不足(2014年歐洲版《少見侵襲性酵母菌感染診療指南》是目前全球唯一涉及毛孢子菌病的診療指南;正文共15頁,但涉及毛孢子菌病僅2頁,且基于循證醫(yī)學(xué)依據(jù)的具體化建議較少);選擇毛孢子菌菌血癥有待解決的重要臨床問題,進行了系統(tǒng)的回顧性病例對照研究和相關(guān)基礎(chǔ)研究。同時,針對病例二長周期治療后菌株出現(xiàn)氟康唑獲得性耐藥的現(xiàn)象(全球首例14年追蹤隨訪患者),以及全球阿薩希毛孢子菌氟康唑臨床耐藥的趨勢,進行體外誘導(dǎo)實驗、動物體內(nèi)誘導(dǎo)實驗以及臨床系列病例分析,探討鈣調(diào)磷酸酶抑制劑在阻斷阿薩希毛孢子菌氟康唑獲得性耐藥中的臨床價值�；谌�40年時間段報道185例毛孢子菌菌血癥的病歷資料進行深入分析,發(fā)現(xiàn)自1975年首次報道以來,該病雖然少見,但全球報道病例的數(shù)量逐漸增加,疾病發(fā)生的地區(qū)和人群更為廣泛。血液系統(tǒng)疾病是最常見基礎(chǔ)病,但其他更多類型基礎(chǔ)病的比重在逐漸增加;危險因素包括:中性粒細(xì)胞減少癥、化療、中心靜脈置管、抗細(xì)菌藥物使用或預(yù)防性/經(jīng)驗性抗真菌治療的病史,且近年來患者病情更為復(fù)雜多樣。多數(shù)患者伴有單個深部組織器官或播散性感染,最常累及的部位是肺臟、皮膚、肝臟、腎臟和脾臟。盡管近年來氟康唑和伏立康唑被更為廣泛應(yīng)用,但患者臨床預(yù)后未見明顯改善;說明指南僅推薦抗真菌藥的治療方案并不能解決患者的綜合臨床問題,因此,急需制定更為全面的治療方案,從而改善臨床預(yù)后�；诒菊n題的結(jié)果對患者進行相對全面的臨床預(yù)后評估:如果具有使用抗細(xì)菌藥物、預(yù)防性/經(jīng)驗性抗真菌治療、伴有細(xì)菌菌血癥或中心靜脈置管未拔除、以及菌株菌種未進行鑒定的情況,患者臨床預(yù)后多數(shù)不佳;如果患者僅是單純真菌血癥(未伴有其他侵襲性組織或器官感染)則臨床預(yù)后更好(現(xiàn)有指南未論述)。作為中國大陸地區(qū)來源的首個毛孢子菌菌血癥臨床研究,研究結(jié)果發(fā)表于美國感染病學(xué)會期刊,并對于毛孢子菌菌血癥患者制定全面的治療方案提出具體化的建議:1、首選使用伏立康唑進行毛孢子菌菌血癥的抗真菌治療;如果臨床無法獲取伏立康唑,可考慮使用氟康唑聯(lián)合兩性霉素B的治療方案(現(xiàn)有指南未論述),病情控制后再使用氟康唑單藥治療。2、伴有低中性粒細(xì)胞血癥的患者:病情允許情況下,調(diào)整免疫抑制劑治療方案,配合給予粒細(xì)胞集落刺激因子或粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子,促進患者外周血粒細(xì)胞水平的恢復(fù),從而改善臨床預(yù)后(現(xiàn)有指南未論述)。3、導(dǎo)管相關(guān)毛孢子菌菌血癥的患者:病情允許情況下,盡早拔除中心靜脈置管;如果病情不允許,建議考慮伏立康唑聯(lián)合兩性霉素B的組合進行封管治療(現(xiàn)有指南未論述)。對于骨髓移植后需要接受抗排異治療的感染患者,建議選擇鈣調(diào)磷酸酶抑制劑作為抗排異治療方案配合氟康唑使用;而對于其他需要長期接受氟康唑治療的患者,還需要進一步篩選出病原真菌特異性的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑進行臨床應(yīng)用;該聯(lián)合方案可能是減少臨床長期用藥導(dǎo)致阿薩希毛孢子菌氟康唑獲得性耐藥的臨床策略,但仍需要更多的臨床數(shù)據(jù)支撐。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R756.6
【圖文】：

圖 5 各時間段報道患者全球分布患者的平均年齡是 47 歲（年齡范圍 0-84 歲）（1 例患者文獻中未述年齡，共 184 例明確年齡進行統(tǒng)計），前三個時間階段均以成年人為主（18-60 歲），最后 10 年的年齡區(qū)段分布較前相對均衡，仍是成年人為主，但是新生兒、兒童和老年人的比例明顯增加，說明該疾病累及的人群在逐漸擴大（圖 6）。10152025303540NumbreofaCes

7Brain, 7Valve, 6Others, 21010203040501975-1984(13) 1985-1994(52) 1995-2004(55) 2005-2014(65)Antimicrobial use NeutropeniaChemotherapy Central venous catheterAntifungal use Corticosteroids useBacterial bloodstream coinfection Intensive care unit admissionNumbreofasesCTime (Decade)圖 9 各時間段患者的診療背景分布者為單純菌血癥，而更多的患者（110 例，59.46%）同時出現(xiàn)了單個深部散性感染的情況，最常累及的部位是肺臟（53 例）、皮膚（47 例）、肝臟（25 例）和脾臟（23 例），此外少有一些其他臟器可能受累，例如：心臟、心血管瓣膜等（圖 10）。

占 45.41%）是臨床鑒定毛孢子菌最常用的方法；但是仍可以看到在近 10 年中，分子學(xué)方法被更多地使用（圖12）。圖 12 各時間段臨床株的鑒定方法分布02040601975-1984(13) 1985-1994(52) 1995-2004(55) 2005-2014(65)Trichosporon.beigelii Trichosporon.asahii Non-asahii TrichosporonTime (Decade)NumbreofasesC

【參考文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 巴根;微進化作用在阿薩希毛孢子菌慢性感染中的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

本文編號：2804444