【摘要】：研究背景孢子絲菌病是由申克孢子絲菌復合體引起的深部真菌感染性疾病。該病病原體為雙相真菌,在不同溫度條件下可產生不同形態(tài)學特征,自然環(huán)境中以菌絲相生長,而感染人體后可適應人體37℃體溫而轉化為酵母相生長。孢子絲菌病除皮膚受累外,致病菌尚可進入淋巴系統(tǒng)并播散全身,引起多系統(tǒng)性損害,嚴重者可致患者死亡。孢子絲菌病呈全球性分布,在熱帶及亞熱帶地區(qū)最高發(fā)病率可達2.5%,我國東北地區(qū)及山東地區(qū)為孢子絲菌病的高發(fā)地帶。孢子絲菌病作為一種機會性感染,由于宿主免疫狀態(tài)和病原體毒力不同,機體感染孢子絲菌后臨床呈不同表型:固定型、皮膚淋巴管型、皮膚播散型和皮膚外型。研究已經證實宿主的遺傳素質在機體抵抗病原體感染中發(fā)揮重要作用,原發(fā)性免疫系統(tǒng)遺傳缺陷可影響宿主的免疫狀態(tài)從而導致不同的臨床轉歸。因此,探討宿主的遺傳素質并從基因水平闡釋人類不同個體間感染差異的本質成為當前研究的一個熱點。已有研究證實CARD9、MBL2、M4SP2等基因缺陷與多種真菌疾病如暗色絲孢霉病、侵襲性曲霉病等易感相關,而孢子絲菌病是否與先天遺傳缺陷相關尚未知。除宿主的遺傳素質外,病原菌的形態(tài)、數(shù)量、毒力因素等也影響到疾病的發(fā)展及預后。既往認為申克孢子絲菌是孢子絲菌病的唯一致病菌種,然而近年來分子生物學研究發(fā)現(xiàn)孢子絲菌病的致病菌實際為6個菌種組成的復合體:狹義申克孢子絲菌、球形孢子絲菌、巴西孢子絲菌、盧里孢子絲菌、墨西哥孢子絲菌、白孢子絲菌,上述菌種在地理分布、致病能力、毒力強弱、臨床表現(xiàn)、藥物敏感性等方面均存在差異。明確病原菌具體型別并闡釋其毒力因素等對臨床疾病的診療及預后將有重要指導意義。而當前對我國孢子絲菌的基因分型研究甚少,且國內目前報道以球形孢子絲菌為主。因此對我國不同地區(qū)分離的孢子絲菌進行基因分型有助于了解我國孢子絲菌病病原菌的現(xiàn)狀,進一步闡釋不同型別的致病菌在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機理,這對臨床診治具有重要意義。基于以上研究背景,本研究主要分以下三部分進行:第一部分61例孢子絲菌病臨床特征分析目的分析本院61例孢子絲菌病臨床資料,總結該病臨床特征。方法回顧性分析本院2015-2017年經真菌培養(yǎng)確診為孢子絲菌病的患者臨床資料,共計61例。統(tǒng)計分析臨床特征,包括患者性別、年齡、居住地、發(fā)病季節(jié)及病程、外傷史、疾病類型及部位、治療以及真菌檢查和病理檢查結果。結果61例患者中男性39例(64%),女性22例(36%),年齡分布從31-87歲不等,平均年齡62.81歲;發(fā)病季節(jié)多見于冬春季節(jié),病程平均2.5月;有明確外傷史者21例(34%);臨床分型為固定型35例(57%),皮膚淋巴管型21例(35%),皮膚播散型5例(8%);皮損分布部位從多到少依次為面部23例(38%),手部17例(28%),上肢15例(24%),四肢及背部1例(2%),面部及下肢1例(2%),下肢4例(6%);平均療程3個月;5例(8%)真菌直接鏡檢見孢子,33(54%)例組織病理中見真菌孢子,28(46%)例組織病理未見真菌結構呈感染性肉芽腫改變。結論61例孢子絲菌病患者均來自山東地區(qū),臨床特征為冬春高發(fā),中老年男性易感且以面部、上肢等暴露部位多見,臨床分型以固定型及皮膚淋巴管型多見。第二部分 宿主先天免疫相關基因缺陷及功能研究目的探討CARD9、MBL2、MASP2基因與孢子絲菌病的相關性,并對發(fā)現(xiàn)的遺傳基因缺陷進行功能實驗驗證。方法對61例孢子絲菌病患者及300例非孢子絲菌病患者的外周血提取DNA,采用Sanger測序方法對CARD9、MBL2、MASP2基因進行PCR擴增及測序。統(tǒng)計樣本中的基因突變情況,運用費舍爾精確檢驗分析比較病例組與對照組之間基因變異差異。運用免疫組化及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分別在病例及對照中對以上基因表達差異進行初步分析。結果CARD9測序結果顯示在3名患者中分別發(fā)現(xiàn)3個不同的突變位點:c.25GA(p.Glu9Lys),c.820_821insG(p.Asp274Glyfs),c.1118GC(p.Arg373Pro),其中c.25GA為本研究發(fā)現(xiàn)的新發(fā)基因突變�；颊咧械淖儺悢y帶率4.9%(3/61)明顯高于本研究中對照人群0%(0/300,P=4.63×10-3,Fisher's exact test)和東亞人群0.09%(4/4291,Exome Aggregation Consortium database,P=8.81×10-5,Fisher's exact test)。MASP2基因測序結果顯示在1名患者4號外顯子發(fā)現(xiàn)1個罕見突變位點:c.477_478insTGCCACAACCAC(CHNH156_159),而在另外匹配的300例對照中(0/300,P=0.169,Fisher's exact test)和東亞人群(0/4290,Exome Aggregation Consortium database,P=0.014,Fisher's exact test)未檢測到以上突變位點。此外MASP2中c.464 AG(p.H155R)、c.1111 GT(p.D371Y)、c.1130 TC(p.V377A)、c.1479 CT(p.S493=)以及MBL2基因中c.161GA(p.G54D)在病例與對照中無顯著性差異(P0.05,Fisher's Test)。免疫組化結果:與對照相比,CARD9在病例組皮膚組織中高表達,病例組中突變者與未突變者中均有高表達。ELISA結果:MBL和MASP2在病例組血清含量低于對照組血清含量,表達有顯著性差異(分別為平均值304 vs 365 ng/ml P=0.002;平均值244 vs 396 ng/ml P=0.022,T test),MASP2突變未影響蛋白表達。結論孢子絲菌病患者群體中CARD9基因及MASP2基因變異率高于對照人群。初步研究顯示基因突變未影響蛋白的表達,但突變是否影響蛋白的功能需要進一步實驗探索。第三部分 致病菌表型特征、基因分型及藥物敏感性研究目的對致病菌進行表型特征、基因分型及體外藥物敏感性試驗,明確山東地區(qū)孢子絲菌病致病菌的菌種類型并為臨床用藥提供指導。方法(1)菌株形態(tài)學鑒定及碳源同化實驗:對所有分離菌株接種于沙堡弱培養(yǎng)基(SDA)27℃,并接種腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(BHI)37℃,進行雙相觀察,同時通過酵母氮源基礎(YNB)液體培養(yǎng)基檢測不同菌株對3種糖(葡萄糖,蔗糖和棉子糖)的同化作用。(2)菌株基因分型:臨床分離出的61株孢子絲菌提取菌株DNA,運用Sanger測序方法進行序列分析。利用核糖體內部轉錄間隔區(qū)(ITS)、鈣調蛋白(CAL)、部分微管蛋白(β-tubulin)基因序列通用引物進行PCR,并將PCR產物進行電泳跑膠,純化后上機測序,將測序結果在NCBI數(shù)據庫及CBS數(shù)據庫進行比對,應用MEGA5.0分子進化分析軟件構建進化樹。(3)體外藥敏試驗:對分離的61株孢子絲菌分別轉種馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基和BHI培養(yǎng)基獲得菌絲相和酵母相菌落,比較兩種生物學形態(tài)的孢子絲菌的體外藥物敏感性差別。采用SensititreTM YeastOneTM藥敏板、微量液基稀釋法檢測菌絲相和酵母相孢子絲菌對臨床常用抗真菌藥物伊曲康唑、兩性霉素B、伏立康唑、泊沙康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、卡泊芬凈、米卡芬凈、阿尼芬凈和特比萘芬的體外敏感性,統(tǒng)計菌絲相及酵母相最低抑菌濃度(MIC)值,計算幾何均數(shù)(GM)、MIC50、MIC90,應用SPSS 19.0軟件對MIC值進行非參數(shù)秩和檢驗,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。結果61株孢子絲菌均可進行雙相轉化,均可同化葡萄糖和蔗糖,不能同化棉子糖。經測序比對及構建進化樹分析,61株菌株均為球形孢子絲菌。經體外藥敏試驗顯示本院臨床分離的孢子絲菌菌株菌絲相及酵母相均對特比萘芬最敏感,其次是伊曲康唑,對氟康唑敏感性最差。同一菌株的酵母相與菌絲相相比,對伊曲康唑、特比萘芬、泊沙康唑、伏立康唑、阿尼芬凈、米卡芬凈、卡泊芬凈、5-氟胞嘧啶敏感性更強(P0.05),而氟康唑、兩性霉素B對菌絲相及酵母相的差異不明顯。結論本院臨床分離的孢子絲菌菌株均為球形孢子絲菌,菌絲相及酵母相均對特比萘芬最敏感,其次是伊曲康唑,對氟康唑敏感性最差。同一菌株的酵母相與菌絲相相比,酵母相敏感性更強。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R756
【圖文】：

逑７．１致病菌致病能力研宄逡逑研宄顯示不同菌種在地理分布（圖２）、毒力、致病能力、臨床表現(xiàn)、藥物敏逡逑感性等方面均存在差異。在孢子絲菌復合體中的６種菌種中，申克孢子絲菌、巴西逡逑孢子絲菌的毒力最強，球形孢子絲菌的毒力居中，墨西哥孢子絲菌、盧里孢子絲菌逡逑的毒力次之，白孢子絲菌的毒力最弱４５。不同地理來源的相同菌種存在差異，如同逡逑為申克孢子絲菌菌種的不同菌株其毒力也不同，可以分為高、中、低不同級別４６。逡逑臨床表現(xiàn)中毒力強的菌種更易侵犯淋巴系統(tǒng)或呈皮膚播散性分布，藥敏研究結果顯逡逑示申克孢子絲菌、巴西孢子絲菌對唑類抗真菌藥物的敏感性較好，而球形孢子絲菌逡逑對特比萘芬的敏感性更強，對唑類抗真菌藥物敏感性差４７－５Ｇ。因此基于以上研究結逡逑果

吞噬和殺滅過程，其發(fā)揮作用的途徑主要通過ＣＢＭ復合體ＣＡＲＤ９－Ｂｃｌｌ０－ＭＡＬＴ１，逡逑激活核轉錄因子ＮＦ－ｋＢ介導機體免疫反應，使效應細胞分泌丨Ｌ－６、ＴＮＦ－ｃｕ邋ＩＬ－１２等逡逑炎癥因子，進一步促進炎癥反應５７－５９。（圖３）逡逑＂＂＾S緬邐畔擼拖赴義希希澹悖簦椋睿戾危模澹悖簦椋睿插義希希粒遙模瑰澹攏悖停蹋希義希停粒蹋裕兀義希義希危棋澹耄洛危掊味　義希海蹋海兀插義賢跡塵奘上赴ü茫蹋沂芴迨侗鷲婢乖安庖叻從Φ男藕磐罰ㄗ曰嬙跡╁義希保跺義

本文編號：2803530