【摘要】：一、研究背景禽流感病毒(avian influenza viruses,AIVs)宿主分布廣泛,目前已經(jīng)突破種屬屏障,不僅造成野禽和家禽感染,而且具備直接感染人類(lèi)的能力,嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和公共衛(wèi)生安全。野禽是禽流感病毒的自然宿主,可作為病毒基因庫(kù),提供遺傳多樣性。感染AIVs的野禽個(gè)體大多數(shù)情況下無(wú)明顯癥狀,能夠長(zhǎng)時(shí)間攜帶病毒遷徙,通過(guò)間接污染環(huán)境水體或直接接觸傳播AIVs。禽養(yǎng)殖場(chǎng)和活禽市場(chǎng)中普遍存在AIVs的感染流行。我國(guó)禽養(yǎng)殖業(yè)飼養(yǎng)總量大,密度高,個(gè)別被感染家禽因無(wú)明顯癥狀得不到及時(shí)處理,家禽普遍感染低致病性禽流感病毒�；钋菔袌�(chǎng)是人類(lèi)感染AIVs的主要暴露場(chǎng)所。大規(guī)模的跨區(qū)域活禽運(yùn)輸和交易,人為的增加了病毒重配機(jī)會(huì),提高了產(chǎn)生新型流感病毒的可能性。AIVs在禽養(yǎng)殖場(chǎng)和活禽市場(chǎng)中的普遍流行必然增加職業(yè)暴露人員感染的風(fēng)險(xiǎn),并且禽暴露人群可能成為AIVs向一般人群傳播的橋梁。豬作為流感病毒的混合器,在不同種屬間傳播起特殊作用。職業(yè)接觸豬的工人同樣需要關(guān)注,以便于更全面的分析和評(píng)價(jià)感染相關(guān)危險(xiǎn)因素。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查顯示,大部分人感染禽流感病例有禽類(lèi)接觸史。而我國(guó)家禽養(yǎng)殖規(guī)模大,禽畜混養(yǎng)的特點(diǎn)和部分地區(qū)居民有購(gòu)買(mǎi)活禽加工食用的生活方式,也增大了人類(lèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)。現(xiàn)有研究多為某一時(shí)間的橫斷面研究,缺乏長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。通過(guò)開(kāi)展對(duì)哨點(diǎn)動(dòng)物,禽養(yǎng)殖場(chǎng),活禽市場(chǎng)中AIVs流行情況和職業(yè)暴露人群中感染風(fēng)險(xiǎn)的監(jiān)測(cè)研究,對(duì)流感的防控具有重要意義。二、研究目的在江蘇省無(wú)錫市太湖開(kāi)展哨點(diǎn)動(dòng)物雞感染禽流感病毒的監(jiān)測(cè),探討自然條件下野禽向家禽傳播禽流感病毒的傳播規(guī)律。開(kāi)展為期三年的對(duì)無(wú)錫市禽養(yǎng)殖場(chǎng)和活禽交易市場(chǎng)中家禽和環(huán)境的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),明確當(dāng)?shù)厍萘鞲胁《镜牧餍星闆r,亞型分布,掌握已知或新發(fā)禽流感病毒生物學(xué)特征,探索病毒變異與遺傳進(jìn)化規(guī)律。同時(shí)進(jìn)行職業(yè)暴露人群和一般人群的隊(duì)列研究,確定職業(yè)暴露人群中禽流感病毒的感染率與發(fā)病率,評(píng)估不同亞型禽流感病毒的感染情況,掌握影響職業(yè)暴露人群和普通人群感染的危險(xiǎn)因素,為將來(lái)流感病毒的預(yù)防和控制提供參考意見(jiàn)。三、研究方法2014年1月至10月在江蘇省無(wú)錫市太湖,對(duì)無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)哨點(diǎn)動(dòng)物雞進(jìn)行監(jiān)測(cè),連續(xù)(4月至6月期間每周1次,其余時(shí)間每月1次)采集泄殖腔和咽拭子標(biāo)本,拍攝記錄與野禽接觸的過(guò)程。通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)篩檢甲型流感陽(yáng)性標(biāo)本,陽(yáng)性標(biāo)本利用SPF雞胚培養(yǎng),復(fù)合感染樣本利用空斑形成試驗(yàn)分離,通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)獲得全基因組序列,分析遺傳進(jìn)化特征。2013年7月至2016年6月間,在無(wú)錫市禽養(yǎng)殖場(chǎng)和活禽市場(chǎng)中進(jìn)行主動(dòng)監(jiān)測(cè),每個(gè)月采集一次禽咽拭子和相應(yīng)環(huán)境標(biāo)本(糞便,污水,籠圈表面擦拭物等),經(jīng)過(guò)qRT-PCR篩檢甲型流感陽(yáng)性標(biāo)本,并利用針對(duì)H5、H7、H9亞型的特異引物進(jìn)一步分型,同時(shí)接種于SPF雞胚或犬腎細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng),采用一步法反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增全基因組或高通量測(cè)序技術(shù)獲得序列結(jié)果,明確禽流感病毒在家禽中感染情況和遺傳進(jìn)化特征。2013年7月至2016年6月同時(shí)期內(nèi),將養(yǎng)殖場(chǎng)和活禽市場(chǎng)符合納入條件的職業(yè)暴露人群(飼養(yǎng)、屠宰、銷(xiāo)售和運(yùn)輸?shù)?和與其年齡匹配的一般人群納入隊(duì)列研究,進(jìn)行為期3年隨訪(fǎng),每年以問(wèn)卷的形式收集人口學(xué)信息和暴露動(dòng)物種類(lèi),時(shí)間,方式等信息,并采集血清,用于血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HI)和微量中和試驗(yàn)(MN)檢測(cè)H7N9,H9N2,H5N1和H5N6亞型抗體水平,所用抗原來(lái)自本研究同時(shí)期從當(dāng)?shù)鼗钋菔袌?chǎng)中分離得到的毒株。計(jì)量資料使用t檢驗(yàn)或方差分析,計(jì)數(shù)資料使用χ~2檢驗(yàn)或精確檢驗(yàn),均為雙側(cè)概率檢驗(yàn),P值小于0.05認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用單因素和多因素Logistic回歸分析計(jì)算比值比(odds ratio,OR)和其95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)用于表示相對(duì)危險(xiǎn)度,使用泊松回歸模型計(jì)算發(fā)病率比IRR(incidence rate ratio)和其95%可信區(qū)間,并依據(jù)年齡和性別進(jìn)行調(diào)整,建立感染危險(xiǎn)因素模型,確定職業(yè)暴露人群不同亞型禽流感病毒發(fā)病率,感染率和相關(guān)危險(xiǎn)因素。四、研究結(jié)果2014年1月至10月期間共采集1623份哨點(diǎn)雞的肛咽拭子樣本,其中364(22.4%)份甲型流感病毒陽(yáng)性,分離到3株AIV毒株其中兩份樣本為H7N2和H9N2共同感染,一份樣本中則含有H5和N6基因片段。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示H7N2毒株是由H7N9和H9N2病毒重配形成的低致病株,而H5N6毒株是由2.3.4分支H5N1病毒和H6N6病毒重配形成的高致病株。哨點(diǎn)雞通過(guò)與野生禽鳥(niǎo)接觸或共享飼料和水,感染禽流感病毒,最終分離到的毒株與從我國(guó)病人和家禽中分離到的毒株高度同源,提示野生禽鳥(niǎo)在向家禽傳播新型禽流感病毒中起到重要作用。2013年7月至2016年6月對(duì)無(wú)錫市禽養(yǎng)殖場(chǎng)監(jiān)測(cè)期間,共采集禽咽拭子標(biāo)本240份及相應(yīng)環(huán)境標(biāo)本284份,共有84(16.0%)份標(biāo)本甲型流感病毒陽(yáng)性,其中24(4.6%)份標(biāo)本H9亞型陽(yáng)性,2(0.4%)份標(biāo)本H5亞型陽(yáng)性,未發(fā)現(xiàn)復(fù)合感染現(xiàn)象。家禽中甲型流感陽(yáng)性率顯著高于相應(yīng)環(huán)境樣本(23.3%vs.9.9%,?~2=17.54,P0.001)。通過(guò)分離測(cè)序,最終獲得4株H9N2病毒,HA和NA基因均屬于Y280系,與我國(guó)大陸地區(qū)家禽中廣泛流行的H9N2優(yōu)勢(shì)株高度近似。HA蛋白具有Q226L(H3編號(hào))位點(diǎn)突變,對(duì)人類(lèi)受體具有結(jié)合作用,同時(shí)NA蛋白具有R292K,M2蛋白具有S31N位點(diǎn)突變,提示對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑和金剛烷胺類(lèi)藥物不再敏感。同時(shí)期對(duì)無(wú)錫市活禽市場(chǎng)的家禽和環(huán)境的監(jiān)測(cè)中,累計(jì)采集3121份標(biāo)本,其中甲型流感核酸檢測(cè)陽(yáng)性726份(23.3%),包括466/2010份(23.2%)咽拭子,145/590份(24.5%)環(huán)境表面拭子和115/521份(22.0%)糞便/污水樣本,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(?~2=0.99,P=0.61)。726份甲型流感陽(yáng)性標(biāo)本中,229份(31.5%),27份(3.7%)和25份(3.4%)分別為H9,H7和H5亞型病毒感染。對(duì)基因序列的分析發(fā)現(xiàn),在活禽市場(chǎng)中至少流行10種不同禽流感病毒亞型(H7N9、H9N2,H2N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H11N2和H1N1),家禽和野禽間,不同亞型間,相同亞型不同分支間重配現(xiàn)象普遍,為新型流感病毒的產(chǎn)生提供了有利條件。從活禽市場(chǎng)分離的所有H5亞型病毒均為高致病性毒株,四株H7N9病毒和所有H9N2病毒對(duì)人類(lèi)受體具有結(jié)合能力,但尚未完全適應(yīng)感染哺乳動(dòng)物。所有的H7,H9和H5亞型毒株在NA莖部中都有不同程度的缺失。所有H9N2病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑具有耐藥性。兩株H5N1病毒與所有H5N2,H1N1,H7N9和H9N2病毒在其M2蛋白發(fā)生S31N位點(diǎn)突變,具有金剛烷胺耐藥性。同期開(kāi)展的職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)隊(duì)列研究中,2013年7月基線(xiàn)調(diào)查共納入1995人,其中禽暴露組511人,豬暴露組569人和對(duì)照組950人,由于職業(yè)暴露工人流動(dòng)性大,三年隨訪(fǎng)中不斷有人員失訪(fǎng)和新納入。禽暴露組,豬暴露組和對(duì)照組累計(jì)有964,1079和1545名不同的研究對(duì)象參與隊(duì)列研究,共采集2070,2026,3436人次血清。禽職業(yè)暴露者對(duì)H7N9,H9N2,H5N1的抗體陽(yáng)性率(0.93%,1.87%,1.87%)比豬職業(yè)暴露者(0.19%,0.28%,0)和對(duì)照組(0.26%,0.58%,0)高,存在顯著性差異(P=0.01,P0.001,P0.001)。而禽暴露組研究期間H7N9抗體陽(yáng)性率基本穩(wěn)定在0.5%的水平,H9N2抗體陽(yáng)性率則由最初的0.2%上升至2%左右。僅從禽職業(yè)暴露人員中發(fā)現(xiàn)H5N1抗體陽(yáng)性的研究對(duì)象,基線(xiàn)時(shí)H5N1抗體陽(yáng)性率(0.20%)較低,隨訪(fǎng)第3年增長(zhǎng)為3.46%。所有研究對(duì)象均未發(fā)現(xiàn)H5N6抗體陽(yáng)性者。研究隊(duì)列中分別有3,20,7位研究對(duì)象的H7N9、H9N2和H5N1病毒存在微量中和抗體滴度4倍升高的陽(yáng)轉(zhuǎn)現(xiàn)象。H7N9病毒在禽暴露組中的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率為0.43%,豬暴露組為0%,對(duì)照組為0.1%;而H9N2病毒在禽暴露者組中觀察到相對(duì)較高的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率(2.78%),在豬暴露者和對(duì)照組中則分別為0.58%和0.39%;H5N1病毒抗體只在1.5%的禽暴露工人中出現(xiàn)陽(yáng)轉(zhuǎn);所有研究對(duì)象中沒(méi)有觀察到關(guān)于H5N6病毒抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。在禽職業(yè)暴露者中,H7N9病毒感染密度(1.27/1000人年)顯著低于H9N2病毒(8.28/1000人年,P0.001)和H5N1病毒(4.46/1000人年,P=0.04)。調(diào)整性別和年齡分組后,禽職業(yè)暴露組相比于對(duì)照組,對(duì)H7N9病毒感染無(wú)顯著性的差異,但更可能發(fā)生H9N2(調(diào)整后IRR=5.98,95%CI:1.91-18.65)和H5N1(P0.001)病毒感染。禽職業(yè)暴露者中不同暴露方式,接觸不同動(dòng)物和性別的感染風(fēng)險(xiǎn)不同。銷(xiāo)售人員感染H9N2風(fēng)險(xiǎn)最高(調(diào)整OR=4.25;95%CI,1.20-25.32),接觸鴿子相比于接觸雞(調(diào)整OR=3.13;95%CI,1.23-8.00),女性比男性(調(diào)整OR=5.48;95%CI,2.38-12.62)發(fā)生H5N1感染的可能更大。對(duì)照組中H9N2抗體滴度陽(yáng)性或陽(yáng)轉(zhuǎn)的危險(xiǎn)因素有性別(調(diào)整OR=8.75;95%CI,1.09-70.45)和慢性呼吸道疾病(調(diào)整OR=7.24;95%CI,1.42-37.00)。五、研究結(jié)論(1)從哨點(diǎn)動(dòng)物SPF雞中分離到新重組的H7N2和H5N6病毒,證明禽流感病毒可以在自然條件下由野生鳥(niǎo)類(lèi)傳播給家禽,并可能通過(guò)基因重配產(chǎn)生新型流感病毒;(2)禽養(yǎng)殖場(chǎng)和活禽市場(chǎng)中普遍存在AIVs的感染流行,以低致病性H9N2病毒為主,且活禽市場(chǎng)中檢測(cè)陽(yáng)性率高于養(yǎng)殖場(chǎng)�；钋菔袌�(chǎng)中AIVs感染情況復(fù)雜,至少存在10種不同亞型AIVs流行,家禽和野禽間,不同亞型間,相同亞型不同分支內(nèi)部基因間重配現(xiàn)象普遍。(3)職業(yè)暴露人群中可能存在H7N9、H9N2和H5N1的隱性感染,但抗體陽(yáng)性率和陽(yáng)轉(zhuǎn)率均在較低水平,未發(fā)現(xiàn)H5N6隱性感染。(4)禽暴露人群相比豬暴露人群和一般人群,H7N9、H9N2和H5N1病毒的感染率更高。禽流感感染人類(lèi)方式主要以禽-人接觸的方式為主。(5)銷(xiāo)售工作中接觸禽(鴿子),性別和患有慢性呼吸道疾病是H9N2和H5N1感染的危險(xiǎn)因素;禽暴露組相比于對(duì)照組,更易于感染H9N2和H5N1病毒,是今后禽流感預(yù)防控制的重點(diǎn)關(guān)注人群。六、意義和創(chuàng)新性通過(guò)開(kāi)展哨點(diǎn)動(dòng)物SPF雞感染禽流感病毒的監(jiān)測(cè),證實(shí)自然條件下禽流感病毒由野鳥(niǎo)傳播給家禽的假設(shè)。無(wú)錫市活禽市場(chǎng)中至少存在10種不同亞型禽流感病毒,病毒重配現(xiàn)象普遍。通過(guò)職業(yè)暴露人群禽流感病毒感染的血清流行病學(xué)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)禽暴露組相比豬暴露組和對(duì)照組,H7N9、H9N2和H5N1病毒的感染率更高。禽職業(yè)暴露者中可能存在H7N9、H9N2和H5N1的隱性感染,未發(fā)現(xiàn)H5N6隱性感染,豬職業(yè)暴露者和一般人群中存在個(gè)別H7N9以及H9N2隱性感染。職業(yè)接觸家禽會(huì)增加感染禽流感病毒的風(fēng)險(xiǎn),禽職業(yè)暴露人群相比于一般人群,更易于感染H9N2和H5N1病毒,是禽流感防控的重點(diǎn)人員。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R511.7
【圖文】：

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文1.1.2 監(jiān)測(cè)地點(diǎn)2014 年 1 月 至 10 月 期 間 ， 選 取 江 蘇 省 無(wú) 錫 市 太 湖 湖 畔 （ 北 緯30°55′40″ 31°32′58″， 東經(jīng) 119°52′32″ 120°36′10″）作為 SPF 哨點(diǎn)雞在自然狀態(tài)下感染禽流感病毒的監(jiān)測(cè)地點(diǎn)（圖 1.1）。太湖是中國(guó)第三大淡水湖，面積約 2338平方公里，位于長(zhǎng)江三角洲地區(qū)，是 40 種候鳥(niǎo)和 19 種留鳥(niǎo)的棲息地，位于候鳥(niǎo)遷徙路線(xiàn)上，是流感發(fā)生熱點(diǎn)地區(qū)。具體位置位于無(wú)錫市境內(nèi)太湖湖畔馬山山腳處一塊平整的土地，露天設(shè)置，約 100 平米空間可供哨點(diǎn)雞自由活動(dòng)。

基于 HA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，兩株 H7N2 病毒與在中國(guó)大陸地區(qū)造成H7N9 第一波和第二波大流行中得到的分離株密切相關(guān)，但卻與第二波從江蘇，浙江和江西分離到H7N9病毒處于另一個(gè)獨(dú)立的分支（穩(wěn)定性檢驗(yàn)為99%（）圖1.2A）。復(fù)合感染的兩株 H9N2 病毒 HA 基因與 A/chicken/Jiangsu/DD6/2013(H9N2)最為接近（圖 1.2C）。NA 基因片段與中國(guó)廣泛流行的 H9N2 病毒和本研究中分離的 H9N2病毒（圖 1.2）處于同一分支，與 2013 年中國(guó)江蘇省家雞的 H9N2 禽流感病毒A/chicken/Jiangsu/WX0204/2013(H9N2)高度同源（圖 1.2B）。而其他 6 個(gè)內(nèi)部基因片 段 也 全 部 源 自 我 國(guó) 廣 泛 分 布 的 H9N2 病 毒 （ 圖 1.3 ） ， 與A/chicken/Qingdao/2144/2013(H9N2) ， A/chicken/Shandong/qd0917/2013(H9N2) ，A/chicken/Beijing/0339/2013(H9N2)，A/chicken/Shandong/0613/2012(H9N2)等最為接近。以上結(jié)果表明兩株 H7N2 流感病毒是由近期在中國(guó)流行的 H7N9 和 H9N2病毒的重配而來(lái)。

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文1.2.3 H5N6 病毒系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)于本研究分離到的 H5N6 病毒，HA 基因系統(tǒng)發(fā)育分析表明該病毒與屬于進(jìn)化枝 2.3.4.4 的廣東省 A/chicken/Dongguan/4259/2013（H5N6）最為接近，可能來(lái)源于 2010 年以來(lái)在中國(guó)家禽中檢測(cè)到的 HXN1，HXN2和 HXN8型高致病性 H5 禽流感病毒以及 2014 年在越南檢測(cè)到的病毒。 H5N6 病毒的 NA 基因片段屬于江西譜系 ， 可 能 來(lái) 源 于 中 國(guó) 福 建 和 廣 東 省 流 行 的 H6N6 禽 流 感 病 毒 ， 與A/chicken/Dongguan/3363/2013（H5N6）最為接近（圖 1.4）。該 H5N6 病毒的六個(gè)內(nèi)部基因與 2013 年至 2014 年間我國(guó)廣東雞鴨分離到的 H5N6 病毒相應(yīng)片段接近，與病人分離的 A/Yunnan/1027/2015（H5N6）處于不同分支（圖 1.5）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號(hào)：2798674