發(fā)布時(shí)間：2017-03-31 15:01

  本文關(guān)鍵詞：B.melitensis外膜蛋白Omp25細(xì)胞毒性作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 構(gòu)建p ET-30a-omp25原核重組質(zhì)粒,表達(dá)并純化Omp25融合蛋白,分析融合Omp25蛋白誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞(BV2)TLR4表達(dá)變化及分泌促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α及HMGB1的能力,并探討Omp25蛋白對誘導(dǎo)BV2細(xì)胞凋亡的作用。方法 從Genbank獲得omp25基因的序列,設(shè)計(jì)引物,使用PCR技術(shù)擴(kuò)增出Omp25蛋白的基因序列,通過分子克隆技術(shù)將該段序列插入到p ET-30a載體中,構(gòu)建p ET-30a-omp25原核表達(dá)載體,以雙酶切及測序方法鑒定載體構(gòu)建是否成功。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入到Ecoli-BL-21感受態(tài)細(xì)菌中,誘導(dǎo)表達(dá)Omp25蛋白,使用Ni-NTA-agarose在變性條件下純化蛋白,通過尿素濃度梯度復(fù)性法復(fù)性純化后的蛋白。Omp25蛋白分別以不同的濃度作用于BV2細(xì)胞,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-q PCR)方法檢測刺激24h后TLR4m RNA的相對表達(dá);ELISA雙抗體夾心法分別檢測IL-6、TNF-α和HMGB1的產(chǎn)生水平;采用流式細(xì)胞術(shù)和Annexin V-FITC-PI檢測法法觀察不同濃度的Omp25蛋白對誘導(dǎo)BV2細(xì)胞凋亡作用的影響。采用單因素方差分析進(jìn)行多組均數(shù)的比較,P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 正確克隆omp25基因,并將omp25基因插入到p ET-30a載體中,成功構(gòu)建了p ET-30a-omp25原核表達(dá)載體。重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能在大腸桿菌中成功表達(dá)0mp25融合蛋白。以不同濃度融合蛋白刺激BV2后,BV2細(xì)胞TLR4 m RNA表達(dá)增加,呈現(xiàn)先增高后降低趨勢,與對照組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。不同濃度Omp25融合蛋白刺激BV2后,TNF-α的分泌增加,呈現(xiàn)先增高后降低趨勢,與對照組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與TLR4表達(dá)變化趨勢一致。不同濃度Omp25蛋白刺激BV2后,HMGB1的分泌增加,呈現(xiàn)先增高后降低趨勢,在5.0μg/ml蛋白濃度刺激下達(dá)到最高峰,與對照組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。細(xì)胞因子IL-6隨蛋白濃度升高呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,與對照組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Omp25蛋白刺激BV2后,會抑制細(xì)胞的凋亡。結(jié)論 成功獲得了Omp25蛋白,Omp25融合蛋白能通過不同濃度誘導(dǎo)BV2細(xì)胞TLR4表達(dá)上調(diào),分泌較高水平的促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和HMGB1,TLR4可能介導(dǎo)參與了布魯氏桿菌侵染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫應(yīng)答過程。Omp25融合蛋白能抑制BV2細(xì)胞發(fā)生凋亡。
【關(guān)鍵詞】：布魯氏桿菌 Omp25 小膠質(zhì)瘤細(xì)胞 腫瘤壞死因子-α 高遷移率族蛋白1
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R516.7;R741
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 中英文縮略詞表8-11
• 前言11-15
• 材料和方法15-29
• 結(jié)果29-45
• 討論45-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 文獻(xiàn)綜述53-68
• 綜述參考文獻(xiàn)63-68
• 致謝68-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文69-70
• 攻讀學(xué)位期間參與的科研課題70-71
• 攻讀學(xué)位期間參加的學(xué)術(shù)會議71

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：B.melitensis外膜蛋白Omp25細(xì)胞毒性作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：279732