【摘要】：背景及目的HIV-1感染長期不進展者(Long term non-progressors,LTNPs)是能天然控制HIV、維持宿主良好免疫的一類特殊人群,其機制與病毒、宿主遺傳特征、免疫應答等多種因素有關,但天然免疫激活水平與長期不進展的關系尚未明確。本研究基于全轉錄組測序展示HIV-1感染長期不進展者和典型進展者的mRNA和非編碼RNA表達譜,通過功能富集分析和ceRNA調控網絡分析,從全轉錄水平分析mRNA和編碼RNA在HIV-1感染長期不進展中的作用,并基于測序結果,在人群水平深入探討關鍵天然免疫信號通路的激活水平與HIV-1感染長期不進展的關系。方法1.轉錄組測序及差異表達分析:選取3例HIV-1感染長期不進展者和3例典型進展者,采集靜脈血,分離PBMC并提取總RNA,構建cDNA文庫并進行高通量測序。經過數據過濾和注釋,獲得mRNA、lncRNA、small RNA和circRNA的表達量并進行差異表達分析。2.功能富集分析:對差異表達的mRNA進行PPI互作網絡分析、GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。對差異表達lncRNA、small RNA和circRNA進行靶基因預測,對靶基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。3.ceRNA網絡構建:根據靶基因預測結果,對具有靶向關系的差異lncRNA、miRNA、mRNA進行共表達分析,表達量呈負相關的miRNA-mRNA對、miRNA-lncRNA對,經過超幾何分布檢驗篩選lncRNA-miRNAmRNA互作關系,構建lncRNA-miRNA-mRNA互作網絡。以同樣的方法構建circRNA-miRNA-mRNA互作網絡。4.NOD樣受體信號通路激活水平檢測:招募HIV-1感染長期不進展者(LTNPs組)、典型進展者(TPs組)、抗病毒治療患者(ART組)和健康對照者(HC組),采集靜脈血,分離PBMC。使用PCR檢測NOD樣受體信號通路中NLRP3、IL-1β和caspase-1的mRNA表達水平,采用流式細胞術檢測各組人群caspase-1即細胞焦亡發(fā)生水平,ELISA檢測血漿中caspase-1、IL-1β含量。5.胞內DNA識別信號通路激活水平檢測:PCR檢測NOD樣受體信號通路cGAS、IFI16等因子的mRNA表達,Western Blot檢測IFI16、STING蛋白表達水平。結果1.差異表達mRNA及其功能:與典型進展者相比,長期不進展者中差異表達的mRNA有543個,其中上調的mRNA 205個,下調338個。GO富集顯示差異表達mRNA主要富集在胞內過程、細胞組分、催化活性等二級GO條目。KEGG富集分析顯示,差異表達mRNA主要富集在胞內DNA識別通路、NOD樣受體信號通路和TNF信號通路等天然免疫相關信號通路。2.差異表達lncRNA及功能:共發(fā)現1297個差異表達lncRNA,長期不進展者中上調的lncRNA 1108個,下調的lncRNA 189個,其中負調控宿主抗病毒應答的lncRNA-NRAV在LTNP組表達下調。3.差異表達small RNA、circRNA及其功能:兩組間差異表達的small RNA有45個,已有功能報道的miRNA有8個。兩組間差異表達的circRNA155個,均為本次研究新預測的circRNA,其中circRNA 090的來源基因為NLRP3。4.lncRNA-miRNA-mRNA互作網絡包含14個miRNA、16個lncRNA和64個mRNA構成的100對互作關系,circRNA-miRNA-mRNA包含17個miRNA、34個circRNA和71個mRNA構成的142對互作關系。T細胞專向分化相關的轉錄因子TCF7均處于以上兩個互作網絡中。5.NOD樣受體信號通路激活水平:LTNPs組、TPs組、ART組和HC組四組人群NOD信號通路中NLRP3的mRNA表達量分別為4.14±3.76、1.90±1.57、2.60±2.73、1.33±1.23,差異具有統計學意義(F=3.202,P=0.030),LTNPs組表達量高于TPs組(t=2.542,P=0.015)。在NLRP3誘導的細胞焦亡發(fā)生水平方面,四組人群外周血PBMC發(fā)生焦亡的水平均較低,caspase-1陽性細胞比例差異無統計學意義(F=0.529,P=0.672)。同樣,血漿的caspase-1含量也未在各組發(fā)現統計學差異(F=0.852,P=0.475)。在通路下游炎癥因子方面,四組人群IL-1β的mRNA表達量和蛋白表達量差異均無統計學意義(P0.05)。6.胞內DNA識別信號通路激活水平:四組人群胞內DNA識別信號通路中,模式識別受體cGAS和IFI16的mRNA表達水平在各組間的差異均有統計學意義(P0.01),并且LTNPs組均低于TPs組(P0.01);通路關鍵中間因子STING和TBK1的mRNA表達水平呈現同樣的趨勢,LTNPs組均低于低于TPs組(P=0.024);進一步在蛋白水平發(fā)現,LTNPs組和TPs組IFI16蛋白相對表達量分別為0.19±0.08、0.54±0.19,LTNPs組低于TPs組,差異有統計學意義(t=2.908,P=0.044);而STING在LTNPs組和TPs組的蛋白相對表達也存在顯著差異(t=3.015,P=0.039),平均值分別為1.85±0.73、3.37±0.47,LTNP組低于TP組。結論1.HIV感染長期不進展人群和典型進展人群的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA表達譜存在較大的差異,富集到多條天然免疫通路可能與HIV長期不進展相關,而非編碼RNA可能通過ceRNA機制調控天然免疫通路中關鍵因子mRNA的表達。2.在HIV感染長期不進展者人群中,未發(fā)現NOD樣受體信號通路的激活,但胞內DNA識別信號通路的cGAS/IFI16-STING的激活水平明顯被抑制,這可能是該人群的疾病不進展的原因之一。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R512.91
【圖文】：

圖 1- 1 全轉錄組測序數據分析流程圖Figure 1- 1 Flow chart of transcriptome sequencing and data analysis.2.2 確定研究對象研究遵循知情同意的原則，并由廣西醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會審核批，在靈山縣疾控中心、柳州市疾控中心等地招募符合納入標準的研究對象究對象分為 HIV-1 感染長期不進展者（LTNPs 組）和 HIV-1 感染典型進者（TPs 組）。在參考既往文獻[50, 51]的基礎上，結合課題組前期研究結果，定本研究中對象的納入與排除標準。研究對象納入和排除標準見表 1-1

HIV-1 感染長期不進展者全轉錄組測序分析以及關鍵天然免疫通路激活水平研究 2019 屆博士學位論文4) mRNA 聚類分析為了顯示 mRNA 在每個樣本的表達情況，對兩組樣本的 mRNA 表達量進行聚類分析。結果顯示，LTNPs 組三個樣本、TPs 組三個樣本分別聚在不同的 cluster 中，同組樣本基因表達具有相同的趨勢，不同組樣本在基因的表達上呈現不同的表達趨勢。（圖 1- 2）

HIV-1 感染長期不進展者全轉錄組測序分析以及關鍵天然免疫通路激活水平研究 2019 屆博士學位論文5) mRNA 組間差異分析組間差異分析即篩選出不同組間存在差異表達的 mRNA，我們以差異倍數≥2 倍及 padj ≤0.05 為條件篩選兩組間差異表達的 mRNA，并繪制火山圖（圖 1-3）。結果顯示，兩組共有 543 個差異表達的 mRNA，與 TPs 組相比，LTNPs 組上調的 mRNA 有 205 個，下調的 mRNA 有 338 個（圖 1-4）。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 王丹;王昆華;;HIV感染期間持續(xù)性免疫激活與腸道微生物易位關系的研究[J];腸外與腸內營養(yǎng);2015年01期

本文編號：2766716