發(fā)布時(shí)間：2020-07-14 14:12

【摘要】：血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人體健康的人畜共患寄生蟲病。目前在世界范圍內(nèi)，約有74個(gè)國家和地區(qū)的6億人受到血吸蟲感染的威脅，有近2億人感染血吸蟲。寄生人體的血吸蟲主要有6種，在中國流行的是日本血吸蟲。 血吸蟲感染具有“伴隨免疫”的特點(diǎn)，患者在其體內(nèi)的血吸蟲蟲體被清除后不久即喪失對(duì)血吸蟲感染的免疫力，當(dāng)再次接觸疫水可發(fā)生再次感染。日本血吸蟲具有大量的保蟲宿主，在自然界能形成血吸蟲病流行的“自然疫源地”。疫區(qū)人群因生產(chǎn)與生活的需要，必須反復(fù)接觸疫水，因而非常容易發(fā)生再感染。血吸蟲蟲卵沉積于肝組織，引起的持續(xù)性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致蟲卵肉芽腫、肝組織纖維化、肝功能障礙、勞動(dòng)力喪失，甚至死亡是血吸蟲感染對(duì)人體健康的主要危害。如果能采取預(yù)防性手段，使血吸蟲幼蟲在進(jìn)入宿主體內(nèi)后立即被殺滅或不能發(fā)育成熟為成蟲并產(chǎn)卵，則可有效降低血吸蟲感染對(duì)人體健康的損害。 目前，由于血吸蟲復(fù)雜的免疫逃避機(jī)制，使預(yù)防血吸蟲感染疫苗的研宄存在嚴(yán)重障礙，現(xiàn)階段控制血吸蟲病流行仍主要依賴于化學(xué)藥物治療。最常用的血吸蟲病治療藥物為吡喹酮，但因其對(duì)血吸蟲童蟲的殺滅效果不佳，不能用于預(yù)防血吸蟲感染。上世紀(jì)八十年代早期，青蒿素及其衍生物的抗血吸蟲活性被中國科學(xué)工作者發(fā)現(xiàn)。與吡喹酮不同的是，此類藥物主要?dú)缤x期的血吸蟲，因此這類藥物主要用于預(yù)防血吸蟲感染與早期治療。有文獻(xiàn)報(bào)道，在青蒿素衍生物中，若使用的劑量相同，青蒿琥酯（ArteSunate,AS)殺滅童蟲的效果要明顯優(yōu)于蒿甲醚等其他衍生物。但青蒿琥酯亦存在半衰期較短，短時(shí)間內(nèi)需反復(fù)用藥，治療成本高，病人的依從性低的缺點(diǎn)。若能延長青蒿琥酯在宿主體內(nèi)的半衰期，則可以使其在宿主體內(nèi)維持有效藥物濃度的時(shí)間延長，不僅可以提高藥物的治療效果，亦可以更有效地預(yù)防血吸蟲感染。在當(dāng)前沒有有效的預(yù)防血吸蟲感染疫苗的情況下，給疫區(qū)人群及家畜使用長效的青蒿琥酯類藥物，應(yīng)該是達(dá)到預(yù)防血吸蟲感染目標(biāo)的理想策略之一。 青蒿琥酯作為一種小分子化學(xué)藥物，其本身及各種代謝產(chǎn)物極易在體內(nèi)被腎小球?yàn)V過而被排出，從理論上講，可以通過增加藥物的流體動(dòng)力學(xué)體積（比如將青蒿琥酯與某種大分子蛋白質(zhì)偶聯(lián)）來延長其半衰期，從而延長青蒿琥酯在體內(nèi)維持有效藥物濃度的時(shí)間，達(dá)到預(yù)防血吸蟲感染的目的。本研宄采用化學(xué)偶聯(lián)方法將青蒿琥酯與一種低免疫原性的人工蛋白一GST-XTEN'融合蛋白偶聯(lián)，形成AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物，試圖延長青蒿琥酯在宿主體內(nèi)的半衰期，制備一種適合用于預(yù)防多種不同保蟲宿主血吸蟲感染的長效藥物，以達(dá)到預(yù)防血吸蟲感染、控制血吸蟲病流行的目的。研宄內(nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面：一、GST-XTEN'融合蛋白的表達(dá)與純化 根據(jù)Volker Schellenberger的設(shè)計(jì)策略，設(shè)計(jì)合成了全長為1368bp,分子量為41.858kDa的XTEN'蛋白基因，并委托上海捷瑞生物工程有限公司合成了編碼XTEN'蛋白的基因片段。將編碼XTEN'蛋白的基因片段通過限制性內(nèi)切}0}0m和/1位點(diǎn)亞克隆到表達(dá)載體pET41a中，構(gòu)建成功重組表達(dá)質(zhì)粒XTEN'-pET41a。將含重組表達(dá)質(zhì)粒XTEN'-pET41a的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用IPTG進(jìn)行蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)。通過對(duì)表達(dá)條件的優(yōu)化，在細(xì)菌靜止生長期用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在37°C誘導(dǎo)4h，可表達(dá)出一分子量約120kDa的可溶性重組GST-XTEN'蛋白二聚體。采用Glutathione sepharose4B膠對(duì)重組蛋白進(jìn)行親和層析純化，獲得純化的重組GST-XTEN'二聚體蛋白，純度大于95%。二、GST-XTEN'蛋白與青蒿琥酯偶聯(lián)物的制備及特性 本研宄根據(jù)青蒿琥酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇將青蒿琥酯長臂上的羧基與蛋白GST-XTEN'結(jié)構(gòu)中的游離氨基用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)，制備了AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物。采用全波長分光光度計(jì)掃描法分別測(cè)定AS、GST-XTEN'和AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物的特征性吸收峰，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物有自己特征性的紫外吸收峰，最大吸收波長為270nm，不同于AS (紫外最大吸收波長為260nm)和GST-XTEN'蛋白（最大吸收波長為280nm)，提示AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物制備成功。偶聯(lián)率為1:506，平均每分子GST-XTEN'載體蛋白上結(jié)合了506個(gè)AS分子。 將日本血吸蟲童蟲轉(zhuǎn)移到預(yù)先加好培養(yǎng)液的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在含5%CO_2的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)孔中分別加入不同濃度的AS、AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物，分別于20min、4h、24h、48h后在倒置顯微鏡下觀察蟲體的死亡情況,同時(shí)設(shè)置RPMI1640對(duì)照組及5%NaHC03對(duì)照組。結(jié)果顯示，AS殺蟲用量小，速度快，而AS-GST-XTEN'同樣具有殺蟲效果，但是用藥劑量大，殺蟲速度慢。設(shè)置不同濃度梯度的AS、AS-GST-XTEN'，分別觀察在各濃度下體外培養(yǎng)的日本血吸蟲童蟲死亡數(shù)量，計(jì)算兩種藥物對(duì)童蟲致死作用的LD5。值。在同等作用時(shí)間內(nèi)，若要達(dá)到相似的殺蟲效果，AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物的劑量（此處指偶聯(lián)物中所含AS的劑量）約是AS劑量的4倍。 使用AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物經(jīng)皮下注射直接免疫ICR小鼠（每只小鼠接種3|ug抗原，不添加任何免疫佐劑），每周一次，連續(xù)免疫六周。每只小鼠于免疫前、第4次免疫后1周（第29天）和第6次免疫后1周（第42天）經(jīng)尾靜脈采血，分離血清。分別以重組GST-XTEN'融合蛋白和AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物為抗原包被酶標(biāo)板，采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，檢測(cè)免疫小鼠血清中抗重組GST-XTEN'蛋白及AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物的抗體IgG效價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：免疫后4周，小鼠血清抗體水平達(dá)到1:1600-1：3200之間，6周后抗體水平達(dá)到1:3200-1：6400之間。表明GST-XTEN'蛋白及AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物仍有一定的免疫原性，但免疫原性較弱。 取66只小鼠，隨機(jī)分為AS組及AS-GST-XTEN'組，兩組小鼠分別經(jīng)尾靜脈注射AS(26.8mg/kg)或AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物(12.05mg/kg)，然后分別在給藥后2min、15min、30min、1h、2h、5h、12h、24h、51h、72h、97h對(duì)小鼠進(jìn)行尾靜脈采血并分離血清，采用ELISA法（雙抗體夾心法）分別測(cè)定給藥后不同時(shí)間點(diǎn)AS組、AS-GST-XTEN'組小鼠體內(nèi)AS含量的變化。檢測(cè)結(jié)果顯示單純注射AS時(shí)，藥物在小鼠血清中迅速達(dá)到峰值（2min)，但半衰期較短（約為30min)，與前人的研宄結(jié)果相吻合。而AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物給藥組小鼠體內(nèi)AS的濃度達(dá)到最高峰的時(shí)間明顯向后推遲，為給藥后的15min，半衰期為給藥后2h，比單純AS的半衰期明顯延長。三、AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物治療與預(yù)防血吸蟲感染效果 為觀察AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物體內(nèi)殺滅血吸蟲童蟲的效果，將30只ICR小鼠，隨機(jī)分為三組，每只小鼠腹部感染日本血吸蟲尾蚴35條，在血吸蟲感染后第七天（肺期）分別經(jīng)尾靜脈注射AS或AS-GST-XTEN'治療，并設(shè)立對(duì)照組。治療劑量為AS注射組150mg/kg，AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物注射組600mg/kg (此處的劑量為偶聯(lián)藥物中所含AS的劑量）。對(duì)照組小鼠不給以任何藥物治療。感染后35天剖殺小鼠，收集成蟲并計(jì)數(shù)，計(jì)算減蟲率。結(jié)果顯示，AS與AS-GST-XTEN'在體內(nèi)對(duì)肺期日本血吸蟲童蟲的殺滅效果類似，均可獲得約60%的減蟲率，兩者差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05)。 在預(yù)防血吸蟲病的試驗(yàn)中，將70只小鼠隨機(jī)分為七組（10只一組），對(duì)每只小鼠均采用尾靜脈注射給藥：組一、組二、組三為AS注射組，注射劑量為150mg/kg；組四、組五、組六為AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物注射組，注射劑量為600mg/kg(此處的劑量為偶聯(lián)藥物中所含AS的劑量）；組七不注射任何藥物，作為空白對(duì)照組。組一、組四、組七在給藥七天后模擬自然環(huán)境感染日本血吸蟲尾蚴，組二、組五在給藥十四天后模擬自然環(huán)境感染日本血吸蟲尾蚴，組三、組六在給藥二十一天后模擬自然環(huán)境感染日本血吸蟲尾蚴，各組小鼠均在感染后35天剖殺，收集成蟲并計(jì)數(shù)，計(jì)算減蟲率。預(yù)防實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組的平均蟲荷為49.00±0.56條，單純給以AS后7天感染組、14天感染組及21天后感染組小鼠體內(nèi)的平均蟲荷數(shù)分別為48.60±0.50條、48.30±0.73條、48.60±0.65條，與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均0.05); AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物給藥后7天、14天和21天感染組，小鼠體內(nèi)的平均蟲荷分別為32.90±0.53條、48.80±0.66條和48.90±0.69條，AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物給藥后7天感染組的減蟲率達(dá)到32.86%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05)。但給藥14天及21天后感染組小鼠體內(nèi)的蟲荷數(shù)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均0.05)。結(jié)論 本研宄成功地構(gòu)建表達(dá)GST-XTEN'融合蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒XTEN'-pET41a，表達(dá)并制備了純化的GST-XTEN'融合蛋白。制備了青蒿琥酯與GST-XTEN'蛋白的偶聯(lián)物（AS-GST-XTEN')。AS-GST-XTEN'偶聯(lián)物免疫原性低，在體內(nèi)、外均具備殺滅血吸蟲童蟲的效果，在宿主體內(nèi)的半衰期有顯著的延長，初步具備了預(yù)防血吸蟲感染的效果。
【學(xué)位授予單位】：江蘇省血吸蟲病防治研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R532.21
【圖文】：

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【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2755067

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