【摘要】：【目的】Hepatitis B Virus(HBV)感染是肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生中最常見的原因,HBV基因組有4個開放讀碼框,其中P基因區(qū)是最大的一個開放讀碼框,目前已有研究發(fā)現(xiàn)HBV-DNA聚合酶,(HBV-DNAP)通過基因突變從而達到免疫逃避及耐藥性的效果,但其對宿主基因的作用機制尚不太清楚,因此本文主要來研究HBV-DNA聚合酶對肝癌細胞的功能學機制的影響。并且借助RNA結合蛋白免疫沉淀(RIP)實驗,通過深度測序找到了其特異性結合的mRNA,并且闡明了HBV-DNAP在肝癌發(fā)生中的作用機制�！痉椒ā渴紫仍诟伟┘毎礖uh7和HepG2細胞中過表達HBV-DNAP基因,然后通過MTT實驗、平板克隆實驗、Transwell遷移以及侵襲實驗表明了HBV-DNAP對肝癌細胞的活性、增殖、遷移及侵襲能力都具有促進作用。為了進一步研究其如何來實現(xiàn)以上功能,我們通過RNA結合蛋白免疫沉淀(RIP)實驗,進行RIP-seq測序,然后將沉淀下來的復合物中的RNA進行分離、純化。然后由北京諾禾致源公司進行深度測序,從而比較與HBV-DNAP特異性結合的mRNA表達豐度,并根據(jù)其提供的GO注釋等對其功能的闡述,然后先篩選了5個與HBV聚合酶P特異性結合的基因,,然后構建了它們的過表達質粒,將其構建在帶有Flag和Myc標簽的載體上。然后通過Western blotting實驗用外源性抗體檢測發(fā)現(xiàn)HBV聚合酶P只對Von Hippel-Lindau(VHL)基因有明顯影響,因此進一步通過RT-qPCR實驗和Western blotting實驗從轉錄和翻譯水平證明了HBV-DNAP能夠下調VHL的表達,并且還通過加入放線菌素D來檢測HBV-DNAP對VHL mRNA穩(wěn)定性的影響,從而證明其通過降解VHL mRNA水平從而下調了VHL的水平,我們又進一步探究了VHL對肝癌細胞的生物學功能的影響,表明VHL能夠抑制對肝癌細胞活性、增殖、遷移以及侵襲能力的影響,因此,為明確HBV-DNAP是否通過VHL來實現(xiàn)其促進肝癌細胞惡性行為的功能,因此又通過挽救實驗證明HBV-DNAP可通過VHL來發(fā)揮其對肝癌細胞活性、增殖、遷移以及侵襲能力的促進作用�！窘Y果】在Huh7和HepG2肝癌細胞中通過細胞功能學實驗表明HBV-DNAP能夠促進肝癌細胞的生長、遷移、侵襲能力以及EMT進程,然后通過RNA結合蛋白免疫沉淀實驗,將沉淀的RNA進一步通過RIP-seq測序,綜合其提供的GO注釋及KEGG分析尋找到了與HBV-DNAP特異性結合的mRNA,通過外源性檢測HBV-DNAP對篩選基因蛋白水平是否有影響,從而確定了特異性基因VHL。然后從mRNA和蛋白水平證明了HBV-DNAP對VHL的影響,最后證明了其能夠下調VHL的表達,而過表達VHL后能夠抑制肝癌細胞的惡性行為,相反敲降VHL后能得到相反的結果,因此猜測HBV-DNAP可能是通過VHL來促進對肝癌細胞生長、轉移及侵襲等惡性行為的影響,因此,最后通過挽救實驗證明了HBV-DNAP能夠通過靶向VHL來實現(xiàn)對肝癌細胞活性增殖、遷移以及侵襲能力的促進作用�！窘Y論】本文發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞系Huh7,HepG2中,過表達HBV-DNAP能夠促進肝癌細胞的生長、遷移、侵襲能力以及EMT的發(fā)生,并且HBV-DNAP能夠下調VHL的表達。而VHL能夠抑制肝癌細胞的生長、遷移、侵襲能力以及EMT進程,進一步通過對其機制的研究,發(fā)現(xiàn)HBV-DNAP通過促進VHL mRNA的降解從而實現(xiàn)對肝癌細胞惡性行為的促進作用。為進一步揭示肝癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制提供了新的探究基礎。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7;R512.62
【圖文】：

圖 1-1：表達質粒 HBV-DNAP 的有效性在 Huh7（A）和 HepG2（B）肝癌細胞中轉染質粒 pCD3/Flag 和 pCD3/Flag-HBV-D轉染后 36h，裂蛋白進行 Western blotting 實驗，檢測其在 Huh7 和 HepG2 細胞中的表1.2.2 HBV-DNAP 促進肝癌細胞的活性為了進一步探究 HBV-DNAP 對肝癌細胞惡性行為的影響，首先通過 M驗分析發(fā)現(xiàn)如圖1-2所示，在不同時間點過表達HBV-DNAP都能使細胞活性圖 1-2：MTT 檢測 HBV-DNAP 對肝癌細胞 Huh7 和 HepG2 細胞活性的影響。A B

1.2.2 HBV-DNAP 促進肝癌細胞的活性為了進一步探究 HBV-DNAP 對肝癌細胞惡性行為的影響，首先通過 MTT 實驗分析發(fā)現(xiàn)如圖1-2所示，在不同時間點過表達HBV-DNAP都能使細胞活性升高。圖 1-2：MTT 檢測 HBV-DNAP 對肝癌細胞 Huh7 和 HepG2 細胞活性的影響。在 Huh7（A）和 HepG2（B）細胞中轉染質粒 pCD3/Flag 和 pCD3/Flag-HBV-DNAP，并在轉染后 48h、72h 和 96h 分別檢測細胞在 A570 的吸光度值（*：p<0.05）1.2.3 HBV-DNAP 促進肝癌細胞的克隆形成能力為了進一步探究 HBV-DNAP 對肝癌細胞克隆形成能力的影響，進行了克隆形成能力實驗。如圖 1-3 所示：HBV-DNAP 明顯促進肝癌細胞 Huh7 和 HepG2 的增殖能力。A BA B

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1 王晉霞;HBV-DNA聚合酶對肝癌細胞惡性行為的調控及機制研究[D];天津醫(yī)科大學;2018年

本文編號：2719841