【摘要】：【目的】Hepatitis B Virus(HBV)感染是肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生中最常見(jiàn)的原因,HBV基因組有4個(gè)開(kāi)放讀碼框,其中P基因區(qū)是最大的一個(gè)開(kāi)放讀碼框,目前已有研究發(fā)現(xiàn)HBV-DNA聚合酶,(HBV-DNAP)通過(guò)基因突變從而達(dá)到免疫逃避及耐藥性的效果,但其對(duì)宿主基因的作用機(jī)制尚不太清楚,因此本文主要來(lái)研究HBV-DNA聚合酶對(duì)肝癌細(xì)胞的功能學(xué)機(jī)制的影響。并且借助RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn),通過(guò)深度測(cè)序找到了其特異性結(jié)合的mRNA,并且闡明了HBV-DNAP在肝癌發(fā)生中的作用機(jī)制。【方法】首先在肝癌細(xì)胞系Huh7和HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HBV-DNAP基因,然后通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移以及侵襲實(shí)驗(yàn)表明了HBV-DNAP對(duì)肝癌細(xì)胞的活性、增殖、遷移及侵襲能力都具有促進(jìn)作用。為了進(jìn)一步研究其如何來(lái)實(shí)現(xiàn)以上功能,我們通過(guò)RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn),進(jìn)行RIP-seq測(cè)序,然后將沉淀下來(lái)的復(fù)合物中的RNA進(jìn)行分離、純化。然后由北京諾禾致源公司進(jìn)行深度測(cè)序,從而比較與HBV-DNAP特異性結(jié)合的mRNA表達(dá)豐度,并根據(jù)其提供的GO注釋等對(duì)其功能的闡述,然后先篩選了5個(gè)與HBV聚合酶P特異性結(jié)合的基因,,然后構(gòu)建了它們的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,將其構(gòu)建在帶有Flag和Myc標(biāo)簽的載體上。然后通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)用外源性抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HBV聚合酶P只對(duì)Von Hippel-Lindau(VHL)基因有明顯影響,因此進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)和Western blotting實(shí)驗(yàn)從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平證明了HBV-DNAP能夠下調(diào)VHL的表達(dá),并且還通過(guò)加入放線菌素D來(lái)檢測(cè)HBV-DNAP對(duì)VHL mRNA穩(wěn)定性的影響,從而證明其通過(guò)降解VHL mRNA水平從而下調(diào)了VHL的水平,我們又進(jìn)一步探究了VHL對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響,表明VHL能夠抑制對(duì)肝癌細(xì)胞活性、增殖、遷移以及侵襲能力的影響,因此,為明確HBV-DNAP是否通過(guò)VHL來(lái)實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)肝癌細(xì)胞惡性行為的功能,因此又通過(guò)挽救實(shí)驗(yàn)證明HBV-DNAP可通過(guò)VHL來(lái)發(fā)揮其對(duì)肝癌細(xì)胞活性、增殖、遷移以及侵襲能力的促進(jìn)作用。【結(jié)果】在Huh7和HepG2肝癌細(xì)胞中通過(guò)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)表明HBV-DNAP能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、侵襲能力以及EMT進(jìn)程,然后通過(guò)RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn),將沉淀的RNA進(jìn)一步通過(guò)RIP-seq測(cè)序,綜合其提供的GO注釋及KEGG分析尋找到了與HBV-DNAP特異性結(jié)合的mRNA,通過(guò)外源性檢測(cè)HBV-DNAP對(duì)篩選基因蛋白水平是否有影響,從而確定了特異性基因VHL。然后從mRNA和蛋白水平證明了HBV-DNAP對(duì)VHL的影響,最后證明了其能夠下調(diào)VHL的表達(dá),而過(guò)表達(dá)VHL后能夠抑制肝癌細(xì)胞的惡性行為,相反敲降VHL后能得到相反的結(jié)果,因此猜測(cè)HBV-DNAP可能是通過(guò)VHL來(lái)促進(jìn)對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及侵襲等惡性行為的影響,因此,最后通過(guò)挽救實(shí)驗(yàn)證明了HBV-DNAP能夠通過(guò)靶向VHL來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞活性增殖、遷移以及侵襲能力的促進(jìn)作用�！窘Y(jié)論】本文發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞系Huh7,HepG2中,過(guò)表達(dá)HBV-DNAP能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、侵襲能力以及EMT的發(fā)生,并且HBV-DNAP能夠下調(diào)VHL的表達(dá)。而VHL能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、侵襲能力以及EMT進(jìn)程,進(jìn)一步通過(guò)對(duì)其機(jī)制的研究,發(fā)現(xiàn)HBV-DNAP通過(guò)促進(jìn)VHL mRNA的降解從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞惡性行為的促進(jìn)作用。為進(jìn)一步揭示肝癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制提供了新的探究基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7;R512.62
【圖文】：

圖 1-1：表達(dá)質(zhì)粒 HBV-DNAP 的有效性在 Huh7（A）和 HepG2（B）肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pCD3/Flag 和 pCD3/Flag-HBV-D轉(zhuǎn)染后 36h，裂蛋白進(jìn)行 Western blotting 實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其在 Huh7 和 HepG2 細(xì)胞中的表1.2.2 HBV-DNAP 促進(jìn)肝癌細(xì)胞的活性為了進(jìn)一步探究 HBV-DNAP 對(duì)肝癌細(xì)胞惡性行為的影響，首先通過(guò) M驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)如圖1-2所示，在不同時(shí)間點(diǎn)過(guò)表達(dá)HBV-DNAP都能使細(xì)胞活性圖 1-2：MTT 檢測(cè) HBV-DNAP 對(duì)肝癌細(xì)胞 Huh7 和 HepG2 細(xì)胞活性的影響。A B

1.2.2 HBV-DNAP 促進(jìn)肝癌細(xì)胞的活性為了進(jìn)一步探究 HBV-DNAP 對(duì)肝癌細(xì)胞惡性行為的影響，首先通過(guò) MTT 實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)如圖1-2所示，在不同時(shí)間點(diǎn)過(guò)表達(dá)HBV-DNAP都能使細(xì)胞活性升高。圖 1-2：MTT 檢測(cè) HBV-DNAP 對(duì)肝癌細(xì)胞 Huh7 和 HepG2 細(xì)胞活性的影響。在 Huh7（A）和 HepG2（B）細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pCD3/Flag 和 pCD3/Flag-HBV-DNAP，并在轉(zhuǎn)染后 48h、72h 和 96h 分別檢測(cè)細(xì)胞在 A570 的吸光度值（*：p<0.05）1.2.3 HBV-DNAP 促進(jìn)肝癌細(xì)胞的克隆形成能力為了進(jìn)一步探究 HBV-DNAP 對(duì)肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響，進(jìn)行了克隆形成能力實(shí)驗(yàn)。如圖 1-3 所示：HBV-DNAP 明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞 Huh7 和 HepG2 的增殖能力。A BA B

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1 王晉霞;HBV-DNA聚合酶對(duì)肝癌細(xì)胞惡性行為的調(diào)控及機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2719841