本文關(guān)鍵詞：C型凝集素CLEC4M對負(fù)載HCV免疫分子的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是當(dāng)今最受關(guān)注的世界性公共健康問題之一,同時(shí)是嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查和世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全世界超過1.7億人感染HCV。初次感染HCV后,約有70%~80%的患者發(fā)展成慢性感染,甚至發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌。中國是HCV感染大國,約有3000萬人群感染,占全球感染總?cè)藬?shù)的1/5,居世界之首,嚴(yán)重危害我國人口健康。根據(jù)我國國情及HCV患者的基因型等,HCV感染者治療方案仍以Peg-IFN-α聯(lián)合RBV為主。自2012年起,慢性丙型肝炎被列為國家十二個(gè)重點(diǎn)疾病之一。肝臟是HCV感染人體的主要靶器官。HCV感染肝細(xì)胞是一個(gè)需要多種細(xì)胞表面受體分子復(fù)合物參與的復(fù)雜過程,具體機(jī)制尚未完全闡明。由于缺乏理想的動物模型,對HCV致病機(jī)制的研究存在許多困難。近年來HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型的不斷更新,促進(jìn)了HCV的研究走向深入。HCV感染肝細(xì)胞,通過病毒包膜蛋白E1和E2與細(xì)胞表面受體CD81、B族I型清道夫受體(SR-BI)、緊密連接蛋白家族即CLDN-1和Occludin等分子的結(jié)合,逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視。最新研究發(fā)現(xiàn),C型凝集素CLEC4M(以下簡稱CLEC4M)可能是介導(dǎo)HCV入胞的重要分子。CLEC4M是一種外源C型植物血凝素的II型跨膜蛋白,基因定位于19p13.3,分子量為46k Da。CLEC4M專一地、大量地選擇性表達(dá)于成熟與未成熟的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴竇內(nèi)皮細(xì)胞及胎盤毛細(xì)血管。天然配體ICAM-3主要表達(dá)于T細(xì)胞上,外源性抗原經(jīng)加工提呈后可以被大量的T細(xì)胞受體(TCRs)識別。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是迄今為止所知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞,刺激初始型T細(xì)胞活化和增殖是DC的標(biāo)志性特征,在免疫反應(yīng)中起著舉足輕重的作用。DC與病毒感染是近年研究熱點(diǎn),其抗感染的功能主要是通過識別病原體結(jié)構(gòu)分子,啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,激活特異性免疫反應(yīng),表現(xiàn)為細(xì)胞因子或趨化因子分泌水平的變化。然而DC是一把雙刃劍,呈遞抗原的同時(shí)又成為病毒的傳播者,充當(dāng)了“特洛伊木馬”的作用。本課題前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),DC表面可以大量表達(dá)CLEC4M分子。因此,我們推測,CLEC4M可能參與HCV的入胞過程,逃逸宿主的免疫攻擊,從而影響T細(xì)胞的免疫功能調(diào)控,而這可能是HCV慢性化的重要原因之一。為了進(jìn)一步研究負(fù)載HCV后的CLEC4M對機(jī)體免疫應(yīng)答水平的影響,本實(shí)驗(yàn)在國家自然科學(xué)基金(No:81170390)資助下進(jìn)行了以下工作:1.慢性丙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞CLEC4M的檢測及臨床意義提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測HCV初治患者、早期病毒學(xué)應(yīng)答組、持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答組和健康對照組的CLEC4M/CD14的表達(dá)率,并分析各組之間的差異。采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)分析慢性HCV患者CLEC4M/CD14的表達(dá)率與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。2.構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)CLEC4M的Huh7.5細(xì)胞系從CD14+細(xì)胞中克隆c CLEC4M基因,成功構(gòu)建GV166-CLEC4M慢病毒表達(dá)載體,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,利用獲得的慢病毒液轉(zhuǎn)染Huh7.5細(xì)胞,獲得穩(wěn)定過表達(dá)CLEC4M的Huh7.5細(xì)胞系,并利用Western Blot和RT-PCR檢測CLEC4M的過表達(dá)情況。3.HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建使用本室保存的包含HCV全長序列的質(zhì)粒p FL-J6/JFH,經(jīng)過酶切線性、DNA純化及T7體外轉(zhuǎn)錄等步驟,獲得全長HCV轉(zhuǎn)錄本。然后利用DMRIE-C轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Huh-7.5細(xì)胞,收集HCVcc的病毒液并進(jìn)行感染性檢測。4.C型凝集素CLEC4M對HCVcc易感性的影響利用已經(jīng)制備好的具有高感染效率的HCVcc病毒液感染穩(wěn)定過表達(dá)CLEC4M的Huh7.5細(xì)胞系,并設(shè)置單克隆抗體干擾組、甘露聚糖感染組和空白對照組。采用免疫熒光檢測和RT-PCR法檢測CLEC4M對HCVcc感染效率的影響。5.樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)鑒定及CLEC4M分子的鑒定預(yù)先提取健康志愿者外周血PBMCs,利用CD14免疫磁珠分選技術(shù)分離CD14+單核細(xì)胞,利用rh GM-CSF和rh IL-4刺激PBMC向DC方向分化,培養(yǎng)第5d加入TNF-α,刺激DC細(xì)胞的成熟。利用流式細(xì)胞儀分別檢測CD14+的分離效率,及CLEC4M在CD14+細(xì)胞的表達(dá)率。通過流式細(xì)胞儀檢測DC的表面標(biāo)志分子CD83和CD86的表達(dá)率,鑒定DC細(xì)胞的成熟,同時(shí)檢測成熟DC細(xì)胞CLEC4M的表達(dá)。6.CLEC4M介導(dǎo)DC負(fù)載HCVcc后,免疫應(yīng)答水平的變化應(yīng)用CLEC4M單克隆阻斷抗體阻斷DC表面CLEC4M的表達(dá)后,再用提前制備好的HCVcc病毒液感染DC,設(shè)置甘露聚糖干擾組、空白對照組。分別收集感染各組的細(xì)胞上清液,采用ELISA法檢測IL-12p70、IL-10的表達(dá)變化。結(jié)論:1.CLEC4M參與了HCV的感染過程。檢測了慢性HCV感染者外周血PBMC中CLEC4M/CD14的表達(dá)率,HCV初治患者中CLEC4M/CD14明顯高于健康對照組、EVR組和SVR組,健康對照組、EVR組及SVR組各組表達(dá)率無顯著性差異,表明CLEC4M參與了HCV的感染過程并誘導(dǎo)了機(jī)體的免疫應(yīng)答從而損傷了肝臟組織,加速疾病的進(jìn)展。2.構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)CLEC4M的Huh7.5細(xì)胞。應(yīng)用HCV細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)(HCVcc)感染過表達(dá)CLEC4M的Huh7.5細(xì)胞,提高了HCVcc的易感性,說明CLEC4M可能參與了HCV的入胞過程。3.誘導(dǎo)成熟DC的培養(yǎng)后,檢測CLEC4M在其表面高表達(dá),再用HCVcc感染DC細(xì)胞,并設(shè)置阻斷實(shí)驗(yàn)組,檢測IL-12p70、IL-10的表達(dá)。結(jié)果顯示陽性對照組IL-12p70、IL-10的水平明顯高于CLEC4M單抗干擾組和甘露聚糖干擾組,說明CLEC4M介導(dǎo)了HCV感染DC,從而影響免疫分子的水平。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎病毒 C型凝集素家族4M 外周血單個(gè)核細(xì)胞 分子受體 樹突狀細(xì)胞 HCV體外培養(yǎng)細(xì)胞模型
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.63
【目錄】：

• 縮略語表6-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-17
• 前言17-19
• 文獻(xiàn)回顧19-30
• 第一部分 慢性丙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞CLEC4M的檢測及臨床意義2530-39
• 1 材料30-33
• 1.1 主要儀器與耗材30
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑30-31
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑配制31-32
• 1.4 研究對象32-33
• 2 方法33-35
• 2.1 密度梯度離心法分離人外周血PBMC33-34
• 2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測CLEC4M的表達(dá)34
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析34-35
• 3 結(jié)果35-37
• 3.1 CD14 及CLEC4M圈門35-36
• 3.2 慢性HCV感染者CLEC4M/CD14 的表達(dá)率36
• 3.3 CLEC4M/CD14 的表達(dá)率與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析36-37
• 4 討論37-39
• 第二部分C型凝集素CLEC4M對HCVcc易感性的影響39-56
• 1 材料39-42
• 1.1 主要儀器與耗材39-40
• 1.2 主要質(zhì)粒和細(xì)胞40
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑40-41
• 1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑配制41-42
• 2 方法42-49
• 2.1 PBMCs分離42
• 2.2 Huh7.5 細(xì)胞及培養(yǎng)42
• 2.3 HCV體外培養(yǎng)體系的制備42-46
• 2.4 穩(wěn)定過表達(dá)GV166-CLEC4M的Huh7.5 細(xì)胞系的建立46-47
• 2.5 Western Blot和RT-PCR檢測Huh7.5 細(xì)胞CLEC4M的表達(dá)47-48
• 2.6 CLEC4M與HCVcc結(jié)合實(shí)驗(yàn)及競爭抑制實(shí)驗(yàn)48
• 2.7 CLEC4M對HCVcc的易感性檢測48-49
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理49
• 3 結(jié)果49-53
• 3.1 pFL-J6/JFH質(zhì)粒酶切線性化及RNA轉(zhuǎn)錄本的鑒定49-50
• 3.2 HCV轉(zhuǎn)染Huh7.5 細(xì)胞免疫熒光50
• 3.3 過表達(dá)GV166-CLEC4M的Huh7.5 細(xì)胞的檢測50-51
• 3.4 免疫熒光檢測CLEC4M對HCVcc的易感性的影響51-52
• 3.5 RT-PCR檢測CLEC4M對HCVcc的易感性的影響52-53
• 4 討論53-56
• 第三部分CLEC4M介導(dǎo)HCV負(fù)載DC的功能變化56-68
• 1 材料56-58
• 1.1 主要儀器與耗材56-57
• 1.2 主要細(xì)胞57
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑57-58
• 1.4 主要溶液配制58
• 2 方法58-61
• 2.1 表達(dá)CLEC4M的DC在體外分離、培養(yǎng)及鑒定58-60
• 2.2 流式細(xì)胞儀檢測DC表型60
• 2.3 CLEC4M介導(dǎo)HCVcc感染DC細(xì)胞60
• 2.4 DC細(xì)胞感染HCV后IL-12p70 和IL-10 的水平的變化60-61
• 3 結(jié)果61-66
• 3.1 光鏡下觀察CD14+細(xì)胞形態(tài)61-62
• 3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD14 分選純度及CELC4M表達(dá)情況62-63
• 3.3 流式細(xì)胞儀檢測DC細(xì)胞表型63-64
• 3.4 CLEC4M介導(dǎo)DC負(fù)載HCV的競爭抑制實(shí)驗(yàn)64-65
• 3.5 ELISA檢測DC上清IL-12p70、IL-10 的表達(dá)65-66
• 4 討論66-68
• 小結(jié)68-69
• 參考文獻(xiàn)69-75
• 個(gè)人簡歷和研究成果75-76
• 致謝76-77

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王媛媛;聶青和;朱婷;;CLEC4M慢病毒載體的構(gòu)建及其在K-562細(xì)胞中的表達(dá)[J];臨床肝膽病雜志;2014年06期

  本文關(guān)鍵詞：C型凝集素CLEC4M對負(fù)載HCV免疫分子的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：271873