【摘要】：人體是一個超個體,其疾病或健康狀態(tài)受到基因與外界環(huán)境的雙重影響,而基因既包括人體自身基因,也包括人體內(nèi)寄居的微生物基因。人體自身微生物廣泛參與機(jī)體的功能調(diào)節(jié)及共代謝,菌群的結(jié)構(gòu)組成以及功能代謝密切影響人體的生理狀態(tài)。人體自身微生物主要來源于人體胃腸道(29%),其次為口腔(26%)和皮膚(21%)。“人類腸道宏基因組計(jì)劃”進(jìn)行了一項(xiàng)規(guī)模最大的腸道菌群基因組研究,構(gòu)建了一個非冗余的4.2M人體腸道微生物基因集參考目錄,為我們進(jìn)行腸道菌群的研究提供了很好的數(shù)據(jù)平臺。腸道微生物菌群是一個可以調(diào)節(jié)的、與人類健康息息相關(guān)的重要內(nèi)分泌器官,數(shù)以萬億的腸道微生物為宿主貢獻(xiàn)了大量的基因資源。腸道菌群被譽(yù)為人體的“第二大基因組”,與肝硬化、肥胖、糖尿病、腸炎等多種疾病具有密切的關(guān)系。我國包括東南亞和非洲等一些國家屬于HBV高流行區(qū),大于8%的人群有慢性HBV感染。慢性感染的成年人中,20%-30%會發(fā)展為肝硬化和/或肝癌。在我國,肝硬化患者中血清HBV DNA陽性率高達(dá)76.7%。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,2015年,乙型肝炎導(dǎo)致88.7萬人死亡,大多死于肝硬化和肝細(xì)胞癌。肝臟參與了機(jī)體各種物質(zhì)的代謝過程,因此,肝臟病變必然導(dǎo)致機(jī)體其它器官的病理改變�？梢�,肝病是全身系統(tǒng)疾病,需要應(yīng)用系統(tǒng)生物學(xué)觀點(diǎn),從整體層面上了解生物體系各個系統(tǒng)的功能。本實(shí)驗(yàn)室前期對乙肝肝硬化患者的腸道菌群宏基因組進(jìn)行了高通量測序及生物信息分析,確定了乙肝肝硬化相關(guān)的腸道菌群結(jié)構(gòu)特點(diǎn),然而,對于功能代謝的研究僅僅是停留在基因水平的預(yù)測,沒有明確的數(shù)據(jù)支持。“組學(xué)”數(shù)據(jù)分析是一個快速發(fā)展的領(lǐng)域,“組學(xué)”技術(shù)中的最新進(jìn)展已經(jīng)為生物學(xué)研究創(chuàng)造了空前的機(jī)會。本課題首次將宏基因組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)和宏代謝組學(xué)的研究相結(jié)合,分析乙肝肝硬化患者腸道菌群的結(jié)構(gòu)及功能特點(diǎn)。根據(jù)CTP評分標(biāo)準(zhǔn),本研究分別選取A、B、C三級的患者作為病例組,選取健康成年人作為對照組。首先,采集研究對象新鮮的糞便樣品,提取宏蛋白質(zhì)組樣本,進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜檢測,并與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,得到蛋白質(zhì)的定性定量信息,構(gòu)建乙肝肝硬化相關(guān)的腸道菌群宏蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫,以及疾病相關(guān)的菌群差異功能蛋白及其變化規(guī)律。為進(jìn)一步驗(yàn)證腸道菌群功能蛋白的作用結(jié)果,本研究進(jìn)一步選取研究對象,提取其糞便樣品中的宏基因組DNA及代謝產(chǎn)物,分別進(jìn)行高通量Miseq測序及HPLC-GC/MS-MS檢測,進(jìn)行腸道菌群結(jié)構(gòu)及代謝產(chǎn)物的鑒定及數(shù)據(jù)分析,確定乙肝肝硬化相關(guān)的腸道菌群代謝產(chǎn)物的差異,及其與腸道菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)系。最終結(jié)合臨床癥狀及組學(xué)分析,全面闡述乙肝肝硬化相關(guān)的腸道菌群微環(huán)境特點(diǎn),并構(gòu)建疾病相關(guān)的腸道微生態(tài)代謝網(wǎng)絡(luò)圖譜。本研究糞便樣品的宏蛋白質(zhì)組測序原始數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳至iprox公共數(shù)據(jù)庫。本研究共檢測到5,020個蛋白,88%來源于細(xì)菌,12%來源于人自身�；颊弑日Ｈ藱z測得到更多的蛋白質(zhì)個數(shù),尤其是B、C級患者,檢測得到蛋白質(zhì)的個數(shù)為正常人的兩倍。對所有蛋白質(zhì)進(jìn)行功能和代謝注釋,發(fā)現(xiàn)患者比正常人注釋得到更多的GO類別和KEGG類別,因此我們推測,隨著疾病進(jìn)展,肝硬化導(dǎo)致的腸道微環(huán)境改變,迫使腸道菌群增強(qiáng)其生長代謝活性及蛋白表達(dá),從而能得以生存。本研究確定了肝硬化相關(guān)的腸道菌群中心宏蛋白質(zhì)組,包括119個蛋白,其中27%的蛋白參與碳水化合物及氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝功能,說明肝硬化相關(guān)的腸道菌群具有較高的代謝活性。本研究篩選出ABC三級患者共有的高表達(dá)蛋白,共得到14個蛋白,涉及到11個代謝通路,其中9個通路涉及碳水化合物和氨基酸相關(guān)代謝。在兩個代謝通路中,患者特有蛋白的數(shù)量隨著病情加重而增加,在C級患者中,特有蛋白幾乎覆蓋了整個代謝通路,這兩個代謝通路分別是:纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸的生物合成;泛酸鹽和輔酶A的生物合成。另外,我們對肝硬化患者及正常人的糞便樣品進(jìn)行了宏基因組學(xué)及宏代謝組學(xué)分析。研究顯示,肝硬化患者的糞便樣品顯著缺失擬桿菌科,同時(shí)腸桿菌科,韋榮球菌科,鏈球菌科的豐度顯著增加。代謝組學(xué)結(jié)果共檢測到108種代謝產(chǎn)物,其中26種代謝產(chǎn)物的豐度在患者及正常人之間具有顯著差異。這26種代謝產(chǎn)物涉及到5個類別,分別是胺,不飽和脂肪酸,短鏈脂肪酸,氨基酸和糖醇。同時(shí),肝硬化患者的腸道微生物群-代謝相關(guān)性發(fā)生改變。肝硬化樣本中尸胺的豐度顯著增加,并與梭狀桿菌的豐度呈正相關(guān)。4-羥基丁酸鹽與酸桿菌門,纖維桿菌門,迷蹤菌門和螺旋菌門呈顯著正相關(guān)。琥珀酸與放線菌門呈顯著正相關(guān)。己酸和庚酸與柔膜菌門呈顯著相關(guān)。我們將本研究有意義的功能蛋白及代謝產(chǎn)物還原到原始的KEGG代謝通路中,共得到7個代謝通路在患者中顯著增強(qiáng),分別是:(1)氮代謝;(2)丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝;(3)纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸生物合成;(4)泛酸鹽和輔酶A生物合成;(5)糖酵解/糖異生;(6)果糖和甘露糖代謝;(7)精氨酸和脯氨酸代謝。根據(jù)以上研究結(jié)果,繪制了乙肝肝硬化相關(guān)的腸道菌群代謝網(wǎng)絡(luò):肝硬化患者腸道中谷氨酸脫氫酶和谷氨酰胺合成酶的高水平表達(dá),直接導(dǎo)致代謝產(chǎn)物谷氨酸的水平升高,谷氨酸鹽會進(jìn)一步參與氮代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等通路。精氨酸和脯氨酸代謝水平的增強(qiáng),導(dǎo)致代謝產(chǎn)物中脯氨酸和腐胺水平的增加,進(jìn)一步降解產(chǎn)生更多的胺,氮代謝增強(qiáng)也會產(chǎn)生更多的胺。果糖和甘露糖代謝水平增強(qiáng),導(dǎo)致代謝產(chǎn)物中甘露醇和山梨醇的豐度增加,這兩種代謝產(chǎn)物進(jìn)一步參與氨基糖和核苷糖代謝途徑。纈氨酸和異亮氨酸的生物合成增加,同時(shí),糖酵解/糖異生代謝通路增強(qiáng),導(dǎo)致產(chǎn)生更多的丙酮酸,進(jìn)入泛酸鹽和輔酶A生物合成通路,也會產(chǎn)生較多的纈氨酸。纈氨酸和異亮氨酸的降解產(chǎn)生較多的胺。本研究是首次乙肝肝硬化相關(guān)的腸道菌群多組學(xué)研究,提出了乙肝肝硬化相關(guān)的腸道微生物中心宏蛋白質(zhì)組的存在,并揭示了肝硬化相關(guān)的腸道微生物代謝網(wǎng)絡(luò)。腸道菌群的異常代謝以及腸道來源的胺的積累會增加患者并發(fā)肝性腦病的風(fēng)險(xiǎn)。基于本研究構(gòu)建的乙肝肝硬化相關(guān)的腸道微生物代謝網(wǎng)絡(luò)圖譜,臨床上,調(diào)節(jié)患者腸道菌群結(jié)構(gòu)及代謝(如氨基酸的代謝),降低胺的產(chǎn)生,從而改善患者腸道微環(huán)境,對于改善患者的預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義。人類肝臟與腸道微生態(tài)菌群存在恒久而重要的共生關(guān)系,從而進(jìn)一步影響人體健康。長期連續(xù)監(jiān)測腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化,實(shí)現(xiàn)疾病的早期預(yù)測,可以為疾病的腸道微生態(tài)治療提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R512.62;R575.2
【圖文】：

A組宏蛋白質(zhì)組提取定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

A組宏蛋白質(zhì)組SDS-PAGE檢測膠圖

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