【摘要】：隱球菌是一種臨床上十分重要、且感染后較難治療的致病真菌,幾乎全部經(jīng)過肺部入侵而感染人體。隱球菌侵入呼吸道系統(tǒng)后,一般情況會被上皮細胞、巨噬細胞等吞噬,臨床上僅表現(xiàn)為咳嗽、低熱、呼吸音減弱等癥狀體征。但如果隱球菌逃避了宿主自身免疫反應,也可侵犯到其他系統(tǒng),如神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng),皮膚及內(nèi)臟系統(tǒng),其中以侵犯神經(jīng)系統(tǒng)愈后最差,致死率高。人類致病隱球菌主要有新生隱球菌和格特隱球菌,其中新生隱球菌感染多發(fā)生于免疫力低下的人群,如白血病、淋巴瘤、長期應用糖皮質(zhì)激素等。近些年隨著HIV感染率的增加和器官移植患者的增加,隱球菌感染率也越來越高。這都說明在隱球菌感染人體過程中,宿主的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)能力發(fā)揮了至關重要的作用。隱球菌入侵人體后,同時激活人體天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng),天然免疫是第一道屏障,效應分子主要有補體系統(tǒng),溶菌酶,細胞因子和一定效應細胞。獲得性免疫針對性更強,可粗略的分為體液免疫和細胞免疫。無論是天然免疫還是獲得性免疫,都受到體內(nèi)大環(huán)境的調(diào)節(jié)。MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)生的、長度約為20-24個核苷酸的小RNA,其在細胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用,特別是在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮的作用,近年來多有報道,比如國外研究發(fā)現(xiàn)miR-15b能夠上調(diào)調(diào)節(jié)性T細胞的表達,從而調(diào)控體內(nèi)免疫反應。調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory cells,簡稱Tregs)是一類控制體內(nèi)自身免疫反應性的T細胞亞群,在天然免疫和適應性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。調(diào)節(jié)性T細胞可分為天然產(chǎn)生的自然調(diào)節(jié)性T細胞(nTreg)和誘導產(chǎn)生的適應性調(diào)節(jié)性T細胞(aT-reg或iTreg),Treg細胞的異常表達與自身免疫性疾病有著密切的關系。調(diào)節(jié)性T細胞主要通過IL-10和TGF-β發(fā)揮免疫抑制作用。近年來人們對白細胞介素-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β在變態(tài)反應免疫抑制中的作用進行了較為詳細的研究,從結果來看,幾乎所有單核巨噬細胞都是IL-10抑制性作用的靶細胞。所以本研究擬在前期實驗基礎上通過肺隱球菌小鼠模型,檢測miR-15b、Treg細胞及IL-10的表達規(guī)律,初步探討宿主感染隱球菌后的體內(nèi)免疫反應機制,尋找可能的治療靶點。研究方法:第一部分,已有報道表明隱球菌誘導THP-1細胞后miR-15b異常表達,我們先將隱球菌與THP-1細胞共培養(yǎng),分別設立0 h、3 h、6 h、9 h、12 h時間點,再次通過聚合酶鏈式反應測得miR-15b表達規(guī)律,以檢驗之前結果的正確性。之后塑造隱球菌肺炎小鼠模型,于感染后1 d、4 d、7 d、11 d、14 d、17 d時間段測得肺隱球菌小鼠外周血中miR-15b表達規(guī)律,流式細胞儀檢測技術檢測了小鼠外周血中Treg細胞所占比例,通ELISA測得感染小鼠外周血IL-10、TNF-α表達規(guī)律。同時我們將小鼠雙肺做切片并嗜銀染色,觀察隱球菌在小鼠肺內(nèi)感染情況。第二部分,予尾靜脈注射miR-15bmimics,通過聚合酶鏈式反應測得miR-15b表達規(guī)律,流式細胞儀檢測技術檢測了小鼠外周血中Treg細胞所占比例,通ELISA測得感染小鼠外周血IL-10表達規(guī)律。第三部分,予小鼠尾靜脈注射miR-15inhibits,之后塑造隱球菌肺炎小鼠模型,于感染后第7 d測得肺隱球菌小鼠外周血中miR-15b表達規(guī)律,感染后第11 d流式細胞儀檢測技術檢測了小鼠外周血中Treg細胞所占比例,通ELISA測得感染小鼠外周血IL-10、TNF-α表達規(guī)律。同時我們將小鼠雙肺做切片并嗜銀染色,觀察隱球菌在小鼠肺內(nèi)感染情況。結果:第一部分:將隱球菌與THP1細胞共培養(yǎng),測得miR-15b表達呈現(xiàn)先緩慢上升,再下降的規(guī)律。隱球菌小鼠肺炎模型小鼠外周血中miR-15b表達規(guī)律同細胞實驗,約在第7天達到高峰,后逐漸降低。流式細胞技術測得Treg細胞表達規(guī)律、ELISA測得IL-10表達趨勢同miR-15b的變化趨勢。小鼠肺組織切片嗜銀染色提示隱球菌在小鼠肺內(nèi)增殖。第二部分:尾靜脈注射miR-15bmimics,7天后測得小鼠外周血中miR-15b表達明顯升高,流式細胞技術測得Treg比例增高,ELISA測得IL-10表達增加。第三部分:予小鼠尾靜脈注射miR-15inhibits后,隱球菌感染小鼠,7天后小鼠外周血中miR-15b表達較未注射miR-15inhibits組(對照組)明顯降低,11天后,流式細胞技術測得Treg比例,ELISA測得IL-10表達均較對照組低,而TNF-α表達較對照組高。小鼠肺組織切片嗜銀染色提示隱球菌數(shù)量較對照組明顯減少。結論:隱球菌感染小鼠后,能夠刺激小鼠體內(nèi)miR-15b高表達,而miR-15b可上調(diào)Treg細胞生成,進一步促進IL-10的表達,從而抑制TNF-α等細胞因子機體防護作用的發(fā)揮,即對隱球菌的清除作用降低,導致隱球菌在宿主體內(nèi)繁殖。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R519
【圖文】：

圖 1.1 新生隱球菌誘導 THP1 細胞，miR-15b 表達規(guī)律）新生隱球菌感染小鼠外周血 miR-15b 表達規(guī)律用新生隱球菌 H99 感染小鼠，提取外周血 RNA 后，采用 Q-PCR 技中miR-15b的表達規(guī)律。如圖 1.2所示，肺隱球菌感染小鼠外周血中 慢，后快速增長，并在大約第 7 天達到峰值，后逐漸下降。

圖 1.1 新生隱球菌誘導 THP1 細胞，miR-15b 表達規(guī)律）新生隱球菌感染小鼠外周血 miR-15b 表達規(guī)律新生隱球菌 H99 感染小鼠，提取外周血 RNA 后，采用 Q-PCR miR-15b的表達規(guī)律。如圖 1.2所示，肺隱球菌感染小鼠外周血中，后快速增長，并在大約第 7 天達到峰值，后逐漸下降。

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本文編號：2717268