【摘要】：背景:白念珠菌是人類真菌感染中最突出的真菌病原體,其致病率日漸升高而目前抗真菌治療手段卻不盡人意。因此有必要進一步研究白念珠菌的致病機制,尋找新的藥物作用靶點。課題組首次報道SPT20基因是白念珠菌重要的毒力基因,其可通過多種途徑調控白念珠菌的活力與毒力。目前罕有對白念珠菌SPT20的研究,其毒力對應的分子機制尚不清楚。但已有報道抗氧化損傷能力是白念珠菌毒力的重要體現(xiàn),因此有必要評估SPT20基因在白念珠菌抗氧化損傷機制中的作用。目的:本研究擬通過基因、蛋白水平探討SPT20基因在白念珠菌抗氧化損傷系統(tǒng)中的作用,進一步揭示其發(fā)揮作用的潛在分子機制。方法:我們在含有H202的YPD培養(yǎng)板上觀察了白念珠菌野生株,SPT20缺失株和SPT20回復株的生長情況。然后利用DCFH-DA檢測了有/無H202刺激下白念珠菌細胞內ROS的水平,并用試劑盒評估關鍵抗氧化酶的活性以及不同菌株細胞內[GSH/GSSG]比率。此外,通過RT-PCR評估白念珠菌STP20缺失株中氧化應答關鍵基因的轉錄情況,并且使用蛋白質印跡試驗闡明Hogl的磷酸化水平。結果:連續(xù)梯度稀釋試驗提示,SPT20的缺失導致白念珠菌對外源性氧化劑H202的敏感性升高。與野生型菌株相比,SPT20缺失株菌體內ROS水平明顯升高,而對清除ROS有關鍵作用的CAT活性明顯降低。同時,體現(xiàn)白念珠菌氧化應激壓力[GSH]/[GSSG]比率明顯升高,SPT20缺失株面臨更高的氧化損傷壓力。RT-PCR結果顯示,SPT20的缺失導致氧化應答相關基因(包括CAT1,和GLR1)的表達水平發(fā)生變化,且與上述結果相符合。蛋白質印跡分析進一步顯示,SPT20的缺失顯著增強了Hog1的磷酸化水平,說明其對白念珠菌調控氧化應答關鍵通路(Hog1-MAPK通路)產生了重要影響。結論:SPT20基因在白念珠菌氧化應答過程中發(fā)揮了關鍵作用,其對白念珠菌抗氧化酶系統(tǒng)、谷胱甘肽系統(tǒng)發(fā)揮正常功能是必需的,并且可能參與氧化應答相關通路的過程,為臨床抗真菌治療提供了潛在的靶點。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R519.3
【圖文】：

通過連續(xù)稀釋點板的方法，將白念珠菌、缺失株、？ＳＰＤＯ回復株在含不同逡逑濃度Ｈ２０２邋ＹＰＤ培養(yǎng)板上生長，３０°Ｃ培養(yǎng)４８ｈ后，觀察菌株的生長情況，實驗逡逑結果如圖３－１所示。逡逑１０＊邋１０：邋１０２邋１０１邋１０邋‘邋１０３邋１０２邋１０１邋１０４邋１０３邋１０２邋１０１邋１０４邋１０３邋１０２邋１０１邋１０‘邋１０３邋１０２邋１０１逡逑ｓｐｔ２０Ａ／Ａ逡逑３ｔｐ２0Ａ／ＳＰＴ２０邐ｊ逡逑ＹＰＤ邐２ｍＭ邋１＾０２邐４ｍＭ邋Ｈ２0２邐６ｍＭ邋Ｈ２0２邐８ｍＭ邋明逡逑圖３－１邋５７Ｔ２０基因缺失后白念珠菌對Ｈ２０２敏感性增高，且隨Ｈ２（）２濃度增加而增高。ＳＰ７７０逡逑基因的引入可逆轉白念珠菌對ｈ２ｏ２的高敏感性。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．邋３－１邋Ｄｅｌｅｔｉｏｎ邋0＼＇ＳＰＴ２０邋ｇｅｎｅ邋ｌｅａｄｓ邋ｔｏ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ邋ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋Ｃａｎｄｉｄａ邋ａｌｂｉｃａｎｓ邋ｔｏ邋Ｈ２0２－逡逑Ｔｈｅ邋ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｉ＇邋ＳＰＴ２０邋ｇｅｎｅ邋ｃａｎ邋ｒｅｖｅｒｓｅ邋ｔｈｅ邋ｈｉｇｈ邋ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋Ｃａｎｄｉｄａ邋ａｌｂｉｃａｎｓ邋ｔｏ邋Ｈ２0２－逡逑由連續(xù)稀釋點板試驗結果可以看到，缺失]株／ｌ：邋ＹＰＤ培養(yǎng)板上１ｄ現(xiàn)逡逑與白念珠南野生株類似的生長狀況，可知敲除后＋會影響白念珠菌生長逡逑狀況ｕ邋ｌ〖ｌＭ丨對環(huán)境屮Ｈ２０２壓力T，缺失株的抵抗能力相比野生株明顯減逡逑弱，回復ＳＰ：Ｔ２（；基因后T逆轉這種情況。說明缺失基因的白念珠菌對Ｈ２０２逡逑的敏感性明顯增高，其抗氧化損傷能力明顯減弱。逡逑３．２邋５７７＾基因缺失株細胞內ＲＯＳ含量明顯上升逡逑作為自由基產生物

ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ邋ｒａｔｅ邋ｏｆ邋ＳＰＴ２０邋ｄｅｌｅｔｉｏｎ邋ｓｔｒａｉｎ邋ｗａｓ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．逡逑我們通過檢測刺激組（６ｍＭ邋Ｈ２０２）和非刺激組４８小時內細胞中熒光強度逡逑的變化情況，比較了不同菌株細胞內ＲＯＳ積累情況。結果如圖３－２所示。結果逡逑３４逡逑

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