【摘要】：目的白念珠菌(C.albicans)是人類最常見(jiàn)的條件致病菌。其感染的特殊性和難治性在于白念珠菌易形成生物膜,生物膜使真菌耐藥性大大增加,感染經(jīng)久不愈。本實(shí)驗(yàn)預(yù)將抗真菌藥物兩性霉素B(Amphotericin B,AmB)包載入PLGA納米粒內(nèi),聯(lián)合低頻低強(qiáng)度超聲(Low-frequency and Low-intensity Ultrasound,LFLIU)輻照,探究超聲聯(lián)合載藥納米粒對(duì)白念珠菌生物膜的體內(nèi)外協(xié)同抗菌作用,以期達(dá)到藥物增效提高治療效果,為臨床真菌生物膜感染治療提供一種新思路。方法1.載兩性霉素B PLGA納米粒(AmB-NPs)的制備及特性檢測(cè):采用雙乳化法制備PLGA納米粒,利用馬爾文激光粒度儀檢測(cè)納米粒的粒徑、電位及分散性,電鏡下觀察納米粒表面及內(nèi)部形態(tài),測(cè)量載藥納米粒48h內(nèi)藥物自然釋放率及一定超聲輻照后藥物的釋放效率,并比較載藥納米粒AmB-NPs與游離藥物AmB對(duì)正常細(xì)胞的毒性。2.超聲聯(lián)合載藥納米粒對(duì)白念珠菌浮游菌的殺菌作用:選擇白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC10231培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,并進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選用固定頻率為42 kHz,換能器直徑約為1.0 cm,輸出聲強(qiáng)為0.15-0.60 W/cm~2連續(xù)可調(diào)的低頻低強(qiáng)度超聲設(shè)備。探究不同超聲強(qiáng)度(0.15,0.30和0.60 W/cm~2)和不同輻照時(shí)間(5,15和30 min)對(duì)白念珠菌浮游菌的影響以篩選適合的超聲劑量。然后聯(lián)合不同濃度AmB載藥納米粒作用于白色念珠菌浮游菌,探究其對(duì)浮游菌活性及結(jié)構(gòu)的影響。3.超聲聯(lián)合載藥納米粒對(duì)白念珠菌生物膜的體外殺菌作用:采用細(xì)胞培養(yǎng)板法建立體外生物膜模型,測(cè)定AmB及AmB-NPs對(duì)白念珠菌生物膜最小抑菌濃度(SMIC)。超聲聯(lián)合載藥納米粒對(duì)白念珠菌生物膜處理后,對(duì)生物膜的活性及生物膜總量進(jìn)行測(cè)定,利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)生物膜作定性和定量分析,并檢測(cè)生物膜分泌的蛋白酶和磷脂酶活性進(jìn)而對(duì)生物膜的毒性進(jìn)行分析。4.超聲聯(lián)合載藥納米粒對(duì)白念珠菌生物膜的體內(nèi)殺菌作用:將白念珠菌菌液浸泡過(guò)的聚氨酯導(dǎo)管植入SD大鼠背部皮下,建立白念珠菌生物膜大鼠皮下感染模型。在治療前,進(jìn)行低頻低強(qiáng)度超聲對(duì)大鼠經(jīng)皮輻照的安全性驗(yàn)證,在超聲聯(lián)合載藥納米粒連續(xù)治療3天和7天后,對(duì)導(dǎo)管表面的菌落進(jìn)行測(cè)定,并通過(guò)激光共聚焦顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)和掃描電鏡(Scanning Electron Microscopy,SEM)觀察導(dǎo)管表面生物膜結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果1.載藥納米粒AmB-NPs特性:光鏡下觀察見(jiàn)兩性霉素B納米粒呈球形,分散性良好,粒徑約為300nm,表面帶負(fù)電荷,透射電鏡下可見(jiàn)藥物清晰包載納米粒內(nèi)部,并計(jì)算出AmB-NPs的載藥率為5.7%,包封率為85%。在48h內(nèi)連續(xù)監(jiān)測(cè)藥物釋放率,結(jié)果顯示超聲能夠明顯促進(jìn)藥物的釋放,48h后,其釋放量約為自然釋放的2倍,這為后續(xù)超聲協(xié)同AmB-NPs提高治療效果提高了有利條件。2.超聲聯(lián)合載藥納米粒對(duì)白念珠菌浮游菌的殺菌作用:在不同超聲劑量作用后,根據(jù)白念珠菌活性的檢測(cè)和透射電鏡觀察,當(dāng)超聲條件為0.30W/cm~2照射15分鐘時(shí),白色念珠菌的細(xì)胞壁屏障被有效破壞,細(xì)胞通透性增加,但白色念珠菌的活性并沒(méi)有明顯減低。因此,聲強(qiáng)0.30W/cm~2、超聲輻照時(shí)間15min為納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的后續(xù)藥物遞送提供了最佳條件。平板培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)顯示超聲聯(lián)合AmB-NPs處理后白念珠菌的存活率下降約(91±0.12)%,且STYO9/PI熒光染色后CLSM觀察:在超聲聯(lián)合AmB-NP作用后,活細(xì)胞數(shù)(綠色熒光)明顯減少,死細(xì)胞數(shù)(紅色熒光)顯著增加。3.超聲聯(lián)合載藥納米粒對(duì)白念珠菌生物膜的體外殺菌作用:經(jīng)結(jié)晶紫染色后觀察,白念珠菌在連續(xù)培養(yǎng)48h后形成主要由細(xì)胞外基質(zhì)組成,具有一定厚度的緊密膜狀結(jié)構(gòu),且XTT減低法定量檢測(cè)生物膜的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)變化結(jié)果也顯示在48-72h,生物膜的生長(zhǎng)曲線變得平緩,吸光值趨于穩(wěn)定,逐漸變達(dá)到成熟狀態(tài)。經(jīng)超聲聯(lián)合AmB-NPs作用于成熟白色念珠菌生物膜后,與對(duì)照組相比,生物膜活性及生物膜總量均顯著降低,下降達(dá)74.64%和31.26%(P0.01)。同時(shí),當(dāng)超聲聯(lián)合AmB-NPs作用后,CLSM觀察到生物膜結(jié)構(gòu)稀疏,厚度變薄,死菌增多,生物膜基本以紅色熒光(死菌)為主,僅基本無(wú)活性生物膜殘留。此外,超聲聯(lián)合載藥微球干預(yù)后可以明顯降低蛋白酶、磷脂酶的活性。4.超聲聯(lián)合載藥納米粒對(duì)白念珠菌生物膜的體內(nèi)殺菌作用:在導(dǎo)管植入皮下72h后導(dǎo)管上真菌的定植量趨于穩(wěn)定,且用結(jié)晶紫染色觀察及掃描電鏡觀察顯示明顯的生物膜結(jié)構(gòu)附著于導(dǎo)管表面。不同劑量超聲照射后大鼠皮膚組織的組織病理學(xué)結(jié)果顯示,超聲輻照的安全閾值為聲強(qiáng)0.3W/cm~2輻照時(shí)間15分鐘。經(jīng)超聲聯(lián)合載藥納米粒治療3天或7天后,超聲聯(lián)合AmB-NPs處理的大鼠的真菌負(fù)載量顯著低于游離AmB處理的大鼠組或接受其他處理的大鼠組(P0.01),且連續(xù)7天治療后效果更明顯。同時(shí)CLSM和SEM觀察顯示經(jīng)超聲與AmB-NPs的聯(lián)合作用之后,在導(dǎo)管表面上生物膜結(jié)構(gòu)被破壞,細(xì)胞外基質(zhì)變少或消失,僅留下單個(gè)真菌菌落,基本上消除了生物膜。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了低頻低強(qiáng)度超聲聯(lián)合PLGA載兩性霉素B納米粒在體內(nèi)外具有協(xié)同抗菌作用,能夠顯著提高對(duì)白念珠菌生物膜的抗菌效果,為臨床治療白念珠菌及生物膜感染提供一種新的思路。 【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R519

【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文聲材料放置在水浴槽的底部以防止超聲波反射。 超聲輻照裝置的示意圖如圖 1所示。在超聲輻照之前，所有樣品保持室溫 22℃。 在超聲輻照完成后，立即將XMZ 數(shù)字顯示溫度控制器的溫度探頭放置在溶液的中心，測(cè)量菌液的即時(shí)溫度，并記錄超聲波照射前后的菌液實(shí)時(shí)溫度。

Rosup 是試劑盒中提供的一種 ROS 陽(yáng)性刺激物。通過(guò)流式細(xì)胞儀定量熒光輕度反應(yīng)細(xì)胞中的 ROS 水平。1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用 SPSS20.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)表示，并采用 GraphPad Prism 5.0 軟件做圖，以 P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)2 結(jié)果2.1 白色念珠菌生長(zhǎng)曲線檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間白色念珠菌菌液的 OD490值，繪制其生長(zhǎng)曲圖 2 所示。這條曲線顯示了白色念珠菌生長(zhǎng)過(guò)程中的遲緩期、對(duì)數(shù)期、衰亡期，，其中本實(shí)驗(yàn)所用白色念珠菌 ATCC10231 在該培養(yǎng)條件下對(duì)數(shù)為 16 h-24 h。

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本文編號(hào)：2712473