【摘要】：目的:作為一個世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題,瘧疾是由來源于瘧原蟲引發(fā)的蟲媒傳染性疾病。根據(jù)2018世界衛(wèi)生組織的瘧疾報告,2017年估計有2.19億例瘧疾感染患者及大約43.5萬人死亡。其中,間日瘧分布廣泛,主要在亞洲和太平洋地區(qū)流行。我國瘧疾主要以間日瘧感染為主。近年來,由于中央和地方各級政府對瘧疾防控工作的支持和投入,一些地區(qū)的瘧疾流行已得到了有效遏制,但在瘧疾高發(fā)的邊境地區(qū),其瘧疾的流行直接影響到我國瘧疾的發(fā)生。我國本土瘧疾已經(jīng)基本消除,瘧疾患者主要來源于輸入性瘧疾感染,其中中緬邊境地區(qū)輸入性間日瘧感染占總數(shù)的73.4%。因此,控制和消滅瘧疾仍然是我國與國際社會的共同目標(biāo)。抗瘧免疫機(jī)制的解析是研發(fā)有效疫苗、制定瘧疾防控策略的前提。研究表明,在很大程度上,保護(hù)性瘧疾免疫與T細(xì)胞免疫應(yīng)答密切相關(guān)。我們以前的研究結(jié)果顯示,在瘧原蟲感染的紅內(nèi)期階段,CD4~+T細(xì)胞發(fā)揮關(guān)鍵的抗瘧保護(hù)作用。其中CD4~+Th1細(xì)胞可以通過分泌IFN-γ來抑制初次侵入的瘧原蟲的快速增殖,而CD4~+Th2細(xì)胞則在瘧疾感染后期通過輔助相應(yīng)B細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體,有效地消滅瘧原蟲,以此阻止這種疾病的復(fù)發(fā)與再燃。CD8~+T細(xì)胞被認(rèn)為是抗肝期瘧原蟲感染的重要細(xì)胞,實驗?zāi)Ｐ偷难芯勘砻鬟@些細(xì)胞直接促進(jìn)感染肝細(xì)胞的裂解和瘧原蟲的死亡,這些事件是由IFN-γ,穿孔素和顆粒酶B調(diào)節(jié)的。瘧原蟲進(jìn)入機(jī)體后產(chǎn)生由眾多免疫細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答,而趨化因子對這些免疫細(xì)胞的遷移與調(diào)節(jié)相應(yīng)的免疫功能具有非常重要的作用。趨化因子超家族是一類在炎癥或病理條件下,誘導(dǎo)粒細(xì)胞沿其濃度梯度遷移運動的可溶性蛋白分子。它們通常是大約8-14kDa的低分子多肽,通過七個跨膜G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)傳遞信號;根據(jù)N末端附近保守的半胱氨酸殘基相對位置的不同,趨化因子可分為CC、CXC、CX3C和C亞族。大量科學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在瘧原蟲侵入人體后,趨化因子對瘧疾形成與抑制發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。瘧原蟲感染可促發(fā)不同趨化因子的水平變化。有資料顯示,CXCR3的配體趨化因子CXCL9與CXCL10在伯氏瘧原蟲感染鼠的腦中高度表達(dá)。與野生型小鼠相比,CXCR3缺陷小鼠在腦瘧中具有明顯的保護(hù)作用,且腦內(nèi)T細(xì)胞明顯減少。瘧疾感染人群中也伴有不同程度趨化因子水平的變化。2015年,我們在云南與緬甸邊境進(jìn)行了瘧疾的流行病學(xué)調(diào)查,并采集了當(dāng)?shù)匾邊^(qū)人群的單核細(xì)胞和血漿樣本,檢測T細(xì)胞亞群的比例與血漿中T細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)的趨化因子的表達(dá)水平,利用統(tǒng)計學(xué)方法來分析各項檢測指標(biāo)與患者基本信息的相關(guān)性以及各T細(xì)胞亞群與相關(guān)的趨化因子之間的內(nèi)在聯(lián)系,為防控間日瘧提供相應(yīng)線索。研究方法:2015年,我們在云南與緬甸邊境進(jìn)行了瘧疾的流行病學(xué)調(diào)查。(1)樣本收集:在符合醫(yī)學(xué)倫理的前提下,并且獲得參與者的知情同意后,記錄他們的基本信息,由醫(yī)學(xué)相關(guān)專業(yè)人員采集相關(guān)的血液樣本,并制備相應(yīng)的血涂片,在顯微鏡下確定瘧原蟲感染類型和對應(yīng)的感染率。共采集患者血漿54份,淋巴細(xì)胞36份,及正常對照血漿22份。(2)實驗分組:流行區(qū)正常對照組:22例癥狀性P.v感染患者:54例(3)使用懸液芯片技術(shù)測定血漿樣本中趨化因子的表達(dá):根據(jù)說明書要求,將含有不同檢測指標(biāo)抗體的磁珠加入到96孔板中,清洗后,將4倍稀釋的血漿樣本和標(biāo)準(zhǔn)品加入每個孔中,避光封閉,振蕩溫育1小時;孵育后,用洗滌液洗滌板三次,在每個孔中加入檢測抗體,避光振蕩孵育30分鐘;再次用洗滌液洗滌板后,向每個孔中加入PE染液,避光振蕩15分鐘后。向每個孔中加入125μl測定緩沖液,震蕩30秒,然后上機(jī)檢測。(4)流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞中CD4~+T細(xì)胞和CD8~+T細(xì)胞亞群比例:常規(guī)細(xì)胞復(fù)蘇后,取1×10~6/ml淋巴細(xì)胞懸液0.1ml,PBS洗滌后,加入抗人CD4和CD8的熒光抗體孵育30 min,PBS洗滌后,通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞亞群比例。統(tǒng)計學(xué)分析:測得實驗數(shù)據(jù)由Bioplex Manager(Bio-Rad Version 4.0)軟件處理,并根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到各檢測指標(biāo)的濃度值。樣本數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件SPSS22.0和GraphPad prism 5進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)分析。采用的統(tǒng)計方法中,兩組數(shù)據(jù)的中位數(shù)比較用Mann-Whitney U檢驗,同時采用Spearman相關(guān)性分析進(jìn)一步分析各趨化因子與患者基本資料之間的相關(guān)性。p0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1.在間日瘧急性感染期,T細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)的趨化因子CXCL9,CXCL10,CXCL11,CXCL13,CCL13和CCL1的水平均顯著升高。2.Th1型細(xì)胞趨化因子CXCL10和Th2型趨化因子CXCL13的表達(dá)水平與間日瘧感染患者的年齡呈正相關(guān)。3.Th1型細(xì)胞趨化因子CXCL10對CD4~+T細(xì)胞的募集可能起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。結(jié)論:在中緬邊境瘧疾流行區(qū),通過檢測間日瘧原蟲感染血液T細(xì)胞亞群分布以及T細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)的趨化因子的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),T細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)的趨化因子CXCL9,CXCL10,CXCL11,CXCL13,CCL13和CCL1可作為間日瘧原蟲感染急性期的敏感性生物指標(biāo),用于診斷早期瘧疾感染。Th1型細(xì)胞趨化因子CXCL10對CD4~+T細(xì)胞的募集起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用,以CXCL10為靶點,為瘧疾免疫干預(yù)策略的確立提供新的實驗依據(jù)。
【圖文】：

A-F 依次為血漿中趨化因子 CXCL9，CXCL10，CXCL11，CXCL13，CCL13 和 CCL1 的表達(dá)水平，數(shù)據(jù)用中位數(shù)和四分位數(shù)表示，采用 Mann Whitney U 檢驗。 *: p<0.05, **: p<0.01, ***:p<0.0013.3 間日瘧原蟲感染患者血漿 T 細(xì)胞相關(guān)的趨化因子水平與年齡的相關(guān)性為探討患者自身狀態(tài)對血漿中上述趨化因子表達(dá)水平的影響，我們進(jìn)一步分析間日瘧感染患者的血漿中趨化因子表達(dá)水平與患者年齡的相關(guān)性，Spearman 分析結(jié)果顯示，Th1/CD8+T 細(xì)胞的趨化因子 CXCL9，CXCL10 和 CXCL11 以及 Th2 型 T細(xì)胞趨化因子 CXCL13 的表達(dá)水平與患者的年齡呈一定正相關(guān)趨勢，，但只有趨化因子 CXCL10（圖 2B）和 CXCL13（圖 2D）的相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)差異（圖 2）。

圖 2 中緬邊境地區(qū)間日瘧感染患者血漿趨化因子水平與年齡的相關(guān)性A-F 依次為血漿中趨化因子 CXCL9，CXCL10，CXCL11，CXCL13，CCL13 和 CCL1 的表達(dá)水平與患者年齡的相關(guān)性，懫用 Spearman 進(jìn)行相關(guān)性分析。 *: p<0.05, **: p<0.013.4 不同性別的間日瘧原蟲感染患者血漿 T 細(xì)胞相關(guān)的趨化因子水平比較分析不同性別對間日瘧感染患者血漿上述趨化因子表達(dá)水平的影響，我們比較了男女患者的血漿趨化因子的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，男性患者和女性患者血漿中的趨化因子 CXCL9，CXCL10，CXCL11，CXCL13，CCL13 和 CCL1 的表達(dá)水平均無顯著性差別（p>0.05），提示性別對趨化因子的表達(dá)無明顯影響(圖 3)。ABC
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R531.3

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本文編號：2711438