【摘要】：背景:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染后能抑制人體的免疫應(yīng)答,造成免疫耐受并導(dǎo)致HBV感染慢性化�？共《臼侵委熉砸倚透窝�(Chronic hepatitis B,CHB)最有效的手段,國(guó)際上各種指南以及我國(guó)的指南均推薦兩大類抗病毒藥物,即干擾素類和核苷(酸)類似物。與核苷(酸)類藥物相比,干擾素類藥物更能有效的使患者獲得乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen,HBs Ag)的血清學(xué)轉(zhuǎn)換,乙肝患者如能實(shí)現(xiàn)HBs Ag的血清學(xué)轉(zhuǎn)換并長(zhǎng)期維持,將可能徹底清除病毒并防止其再次入侵。然而,干擾素治療后乙肝患者的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全清楚。作為乙肝病毒表面抗體(Hepatitis B virus surface antibody,HBs Ab)來(lái)源的B細(xì)胞在清除HBV的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。B細(xì)胞活化和分化受到濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper cells,Tfh)的調(diào)控,而Tfh是定位于淋巴濾泡中的一類CD4和CXCR5雙陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞亞群,其主要轉(zhuǎn)錄因子為Bcl-6,膜表面高度表達(dá)ICOS、PD-1、CD40L等分子。Tfh細(xì)胞又可以根據(jù)其分泌的IFN-γ、IL-4、IL-17分為T(mén)fh1、Tfh2、Tfh17三種不同的細(xì)胞亞群,研究表明這些細(xì)胞亞群在B細(xì)胞的分化、成熟以及免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換過(guò)程中起著各自不同的信息傳遞作用。已有研究證實(shí),Tfh細(xì)胞參與了HBV感染后的抗病毒免疫過(guò)程。迄今為止,尚沒(méi)有干擾素治療CHB患者的過(guò)程中,Tfh細(xì)胞頻率、功能、生物學(xué)意義及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究。目的:研究長(zhǎng)效干擾素聚乙二醇干擾素-α(Pegylated interferon alpha,PEG-IFN-α)治療前后的CHB患者,Tfh細(xì)胞和B細(xì)胞在抗病毒免疫應(yīng)答中的功能變化,探討Tfh細(xì)胞調(diào)控B細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體的途徑,以期提高乙肝抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換的效率,為臨床治愈乙肝提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。方法:本研究納入CHB患者59例,以及年齡、性別相匹配的健康對(duì)照者(Healthy controls,HC)15例。CHB患者接受標(biāo)準(zhǔn)48周PEG-IFN-α治療,并隨訪至96周,根據(jù)治療后患者的應(yīng)答情況分為完全應(yīng)答組(Complete Response Group,CRG),不完全應(yīng)答組(Incomplete Response Group,ICRG),無(wú)應(yīng)答組(Non-Response Group,NRG)。利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CHB患者應(yīng)用PEG-IFN-α治療前和治療后12、48、96周不同時(shí)相點(diǎn)以及對(duì)照組外周血中Tfh細(xì)胞表面標(biāo)記物CD3/CD4/CXCR5/CD40L/ICOS/PD-1和B細(xì)胞表面標(biāo)記物CD19/CD20/CD21/CD38/CD138的表達(dá)水平。流式分選獲得健康人和患者外周血或扁桃體中的Tfh細(xì)胞、B細(xì)胞,并通過(guò)體外共培養(yǎng)體系驗(yàn)證治療后不同應(yīng)答反應(yīng)患者Tfh細(xì)胞輔助B細(xì)胞分化及抗體分泌的功能差異,同時(shí)利用體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究IFN-α或HBV對(duì)Tfh細(xì)胞功能性分子表達(dá)的影響。應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析患者外周血中Tfh細(xì)胞的基因表達(dá)譜、免疫熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)CHB患者肝穿組織中的Tfh細(xì)胞表面標(biāo)記物CD40L/ICOS的表達(dá)水平、流式微球陣列(CBA)實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-a、IL-17A、IL-10、IL-6、IL-4和IL-2的濃度以及免疫球蛋白Ig G、Ig A、Ig M的含量。結(jié)果:1.本研究59例納入者中,有42例CHB患者完成了標(biāo)準(zhǔn)48周PEG-IFN-α的治療,并隨訪至96周。根據(jù)治療后的患者應(yīng)答情況,CRG組為14例,ICRG組為8例,NRG組為20例。2.流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn),PEG-IFN-α治療前,CHB患者外周血中CD38hiCD138~+漿細(xì)胞、Ig G~+CD21~+B細(xì)胞、CD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞、ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞、CD40L~+CD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞和PD-1hiCD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞頻率以及血清Ig G、Ig M水平均高于HC組,Tfh1細(xì)胞頻率低于HC組,而Tfh2細(xì)胞和Tfh17細(xì)胞頻率沒(méi)有顯著差異。動(dòng)態(tài)分析PEG-IFN-α治療前和治療后12、48、96周不同時(shí)相點(diǎn)外周血中Tfh細(xì)胞和B細(xì)胞亞群的頻率以及血清免疫球蛋白的變化,發(fā)現(xiàn)ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞、CD40L~+CD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞、Tfh1細(xì)胞、CD38hiCD138~+漿細(xì)胞、Ig G~+CD21~+B細(xì)胞頻率以及血清Ig G、Ig M水平在CRG組中隨著治療呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的增加并在48周時(shí)達(dá)到高峰。而且PEG-IFN-α治療48周后,CRG組患者外周血中ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞、CD40L~+CD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞、Tfh1細(xì)胞、CD38hiCD138~+漿細(xì)胞、Ig G~+CD21~+B細(xì)胞頻率以及血清Ig G、Ig M水平均高于NRG和ICRG組。3.經(jīng)相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)CD40L~+CD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞的頻率分別與HBs Ab濃度、CD38hiCD138~+漿細(xì)胞、Ig G~+CD21~+B細(xì)胞和血清Ig G水平正相關(guān),而ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞與這些指標(biāo)均沒(méi)有相關(guān)性。4.免疫熒光共聚焦技術(shù)發(fā)現(xiàn),CHB患者肝組織中CD40L~+CD4~+CXCR5~+和ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞頻率升高,而且CXCR5~+CD40L~+和CXCR5~+ICOS~+Tfh-like細(xì)胞與B細(xì)胞在位置上緊鄰。5.體外實(shí)驗(yàn)中,來(lái)自于不同應(yīng)答組和健康對(duì)照組的Tfh細(xì)胞與來(lái)自于同一健康捐贈(zèng)者的B細(xì)胞共培養(yǎng),對(duì)比于NRG和HC組,CRG組Tfh細(xì)胞具有更強(qiáng)的促進(jìn)B細(xì)胞分化為記憶B細(xì)胞以及產(chǎn)生抗體的能力。利用Transwell體系進(jìn)行Hep G2.215細(xì)胞與外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),HBV抑制了Tfh細(xì)胞上CD40L的表達(dá);共培養(yǎng)體系中添加重組人蛋白IFN-α?xí)碳fh細(xì)胞上CD40L和ICOS的高表達(dá);當(dāng)用anti-CD40抗體阻斷CD40-CD40L途徑比用anti-ICOS抗體阻斷ICOS-ICOSL途徑更能減少I(mǎi)g G~+B細(xì)胞的產(chǎn)生。6.基因芯片技術(shù)分析不同應(yīng)答組外周血Tfh細(xì)胞的基因表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)CRG組中Tfh細(xì)胞CD40L以及干擾素刺激因子基因的表達(dá)高于NRG和ICRG組,而ICOS并沒(méi)有顯著變化。結(jié)論:1.CHB患者外周血和肝內(nèi)CD40L~+CD4~+CXCR5~+Tfh、ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞的頻率升高,且肝組織中Tfh-like細(xì)胞與B細(xì)胞位置上緊鄰,表明Tfh細(xì)胞可能直接調(diào)節(jié)B細(xì)胞的活性,這與肝臟的損害可能有密切的聯(lián)系,驗(yàn)證了Tfh細(xì)胞直接參與CHB的發(fā)病機(jī)制。2.循環(huán)Tfh1細(xì)胞頻率在CHB患者中顯著減少,經(jīng)PEG-IFN-α治療后在CRG組顯著升高,表明Tfh1細(xì)胞可能參與了CHB的發(fā)病機(jī)制,且在HBV清除的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。3.PEG-IFN-α治療后,CD40L~+CD4~+CXCR5~+Tfh和ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞頻率在CRG組中升高,且Tfh細(xì)胞具有更強(qiáng)的能力促進(jìn)B細(xì)胞分化以及抗體的產(chǎn)生,表明PEG-IFN-α治療增強(qiáng)CRG組患者Tfh細(xì)胞輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力,從而促進(jìn)HBs Ag的血清學(xué)轉(zhuǎn)換。4.體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HBV的存在抑制Tfh細(xì)胞上CD40L的表達(dá),這可能是機(jī)體免疫耐受狀態(tài)形成的原因之一,而IFN-α能夠間接誘導(dǎo)Tfh細(xì)胞CD40L和ICOS的表達(dá)。5.發(fā)現(xiàn)并證明了CD40L~+CD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞比ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh細(xì)胞更能有效的激活B細(xì)胞,促進(jìn)HBs Ab的產(chǎn)生,達(dá)到HBs Ag的血清學(xué)轉(zhuǎn)換。尋找更有效的刺激CD40L的表達(dá)方法,進(jìn)而有效的激活免疫耐受狀態(tài)下的Tfh-B細(xì)胞軸,或可成為未來(lái)CHB的新型治療手段。
【圖文】：

圖 2.1 乙肝病毒感染的持續(xù)性是由多個(gè)細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用決定的[19]Figure 2.1 The persistence of HBV infections is determined by the complexinteractions of multiple leukocytes.2.1.1 固有免疫系統(tǒng)

圖 2.2 濾泡輔助性 T 細(xì)胞的分化和抑制是一個(gè)多階段、多因子參與的過(guò)程[71]Figure 2.2 Follicular helper T cell differentiation and inhibition is multi-step,multifactorial2.2.3 Tfh 細(xì)胞的分子標(biāo)記物
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R512.62

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本文編號(hào)：2707247