【摘要】：目的:肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSECs)通過誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞耐受,在維持肝內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。然而,某些病毒感染或TLRs刺激可誘導(dǎo)LSECs功能成熟并逆轉(zhuǎn)其抑制屬性從而誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫。到目前為止,人們對(duì)于HBV感染過程中LSECs能否以及怎樣調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫仍知之甚少。本研究旨在探討HBV感染過程中肝竇內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞免疫的功能及其機(jī)制。材料與方法:1.雄性6-8W齡C57BL/6小鼠,購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。2.分別用急性HBV質(zhì)粒p SM2、慢性HBV質(zhì)粒p AAV/HBV1.2高壓尾靜脈注射構(gòu)建HBV急、慢性復(fù)制小鼠模型。于特定時(shí)間點(diǎn)處死小鼠并分離肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、肝細(xì)胞,與多克隆活化T細(xì)胞共孵育,ELISA檢測共孵育48h上清中IFNγ水平。3.體外用HBs Ag、HBe Ag、HBc Ag刺激野生型小鼠肝血竇抗原提呈細(xì)胞24h后,與多克隆活化T細(xì)胞共孵育,ELISA檢測共孵育48h上清中IFNγ水平。4.實(shí)驗(yàn)組小鼠高壓尾靜脈注射HBe Ag短時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3.1/HBe Ag,對(duì)照組小鼠高壓尾靜脈注射不表達(dá)HBe Ag對(duì)照質(zhì)粒pc DNA3.1/null,2dpi后分離小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞,與多克隆活化T細(xì)胞共孵育,ELISA檢測共孵育48h上清中IFNγ水平。5.分別予以高壓尾注射p BS/HBV1.3+p CI-neo/null、p BS/HBV1.3-HBe Ag(-)+p CI-neo/null、pBS/HBV1.3-HBe Ag(-)+pCI-neo/HBe Ag構(gòu)建HBV正常復(fù)制、HBe Ag缺陷表達(dá)、HBe Ag補(bǔ)充三種HBe Ag不同水平體內(nèi)表達(dá)模型,于特定時(shí)間點(diǎn)采血及處死小鼠,分離小鼠肝內(nèi)浸潤淋巴細(xì)胞、脾組織淋巴細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞,ELISA檢測小鼠血清中HBe Ag、HBs Ag,流式檢測肝內(nèi)浸潤淋巴細(xì)胞、脾組織淋巴細(xì)胞T細(xì)胞活化表型(CD25、CD69、CD62L、PD1、CD44)以及T細(xì)胞功能(IFNγ、TNFα、IL-2);將各組小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞與多克隆活化T細(xì)胞共孵育,ELISA檢測共孵育48h上清中IFNγ水平。6.流式檢測HBV肝內(nèi)復(fù)制第14dpi以及HBe Ag體外刺激的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞共刺激分子(MHCⅠ、MHCⅡ、CD80、CD86、PD-L1)表達(dá);流式CBA及ELISA檢測HBV肝內(nèi)復(fù)制14dpi以及HBe Ag體外刺激的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)24h上清中炎性細(xì)胞因子表達(dá)(TNFα、IL-6、IL-10、MCP1、IL-27)。7.在na?ve小鼠LSECs與多克隆活化T細(xì)胞共孵育體系中加入TNFα或IL-27重組蛋白,ELISA檢測共孵育48h上清中IFNγ水平;在HBe Ag體外刺激的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞與多克隆活化T細(xì)胞共孵育體系中加入TNFα或(和)IL-27中和性抗體,ELISA檢測共孵育48h上清中IFNγ水平。結(jié)果:1.與對(duì)照組相比,HBV急性、慢性肝內(nèi)復(fù)制第14dpi可誘導(dǎo)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞逆轉(zhuǎn)其耐受屬性并促進(jìn)T細(xì)胞免疫,且HBV急性肝內(nèi)復(fù)制組肝竇內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ的水平高于HBV慢性肝內(nèi)復(fù)制組及對(duì)照組。HBV肝內(nèi)復(fù)制對(duì)庫普弗細(xì)胞和肝細(xì)胞功能影響并不大。2.HBV蛋白組分(HBe Ag、HBs Ag)體外刺激可誘導(dǎo)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞功能成熟并促進(jìn)T細(xì)胞免疫;HBV蛋白組分(HBe Ag、HBs Ag)體外刺激增強(qiáng)庫普弗的抑制屬性并誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受。3.HBe Ag體內(nèi)、體外刺激均能誘導(dǎo)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞功能成熟并促進(jìn)T細(xì)胞免疫。4.與HBV正常復(fù)制組相比,HBe Ag缺陷表達(dá)組T細(xì)胞功能減弱;HBe Ag體內(nèi)補(bǔ)充能更好的促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞功能活化、修復(fù)T細(xì)胞功能并加速病毒清除。5.HBV急、慢性肝內(nèi)復(fù)制對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞共刺激分子的表達(dá)無明顯影響;與HBV慢性肝內(nèi)復(fù)制組及對(duì)照組相比,HBV急性肝內(nèi)復(fù)制誘導(dǎo)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞能產(chǎn)生更高水平的TNFα、IL-27、IL-10。6.HBe Ag體外刺激誘導(dǎo)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生TNFα、IL-27、IL-10、MCP1高于對(duì)照組;HBe Ag體外刺激促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上調(diào)MHCⅠ類分子、下調(diào)PD-L1。7.在LSECs與T細(xì)胞共孵育體系中補(bǔ)充TNFα或IL-27可解除LSECs對(duì)T細(xì)胞的抑制作用;TNFα或IL-27體外阻斷可部分消除HBe Ag刺激的LSECs促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力。結(jié)論:HBV肝內(nèi)復(fù)制可逆轉(zhuǎn)LSECs的抑制特性并促進(jìn)T細(xì)胞免疫,這可能部分是由HBe Ag誘導(dǎo)LSECs產(chǎn)生TNFα和IL-27所介導(dǎo)。HBV誘導(dǎo)LSECs免疫功能成熟的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)(1)首次在HBV高壓水注射模型中發(fā)現(xiàn)HBV感染能誘導(dǎo)肝血竇固有抗原提呈細(xì)胞LSECs功能活化,而對(duì)其他肝血竇抗原提呈細(xì)胞如KCs、肝細(xì)胞影響并不大,為靶向增強(qiáng)肝內(nèi)免疫提供了重要線索。(2)首次發(fā)現(xiàn)HBe Ag能誘導(dǎo)LSECs和KC發(fā)生免疫功能差異分化,將對(duì)尋找慢性乙型肝炎免疫治療的新策略提供重要線索和理論依據(jù)。(3)首次對(duì)HBV感染過程中肝竇內(nèi)皮細(xì)胞功能活化的具體分子機(jī)制加以闡述,理論創(chuàng)新性強(qiáng),研究成果將為闡明HBV感染慢性化的肝內(nèi)機(jī)制提供新思路。
【圖文】：

HBV 表面抗原(HBsAg)，e 抗原(HBeAg)清除情況，如圖 1 所示：急性和慢性 HBV 復(fù)制小鼠血清中 HBsAg 和 HBeAg 均于高壓尾靜脈注射后第 1 天(1dpi)呈現(xiàn)一個(gè)高水平表達(dá)；急性 HBV 復(fù)制小鼠表面抗原的表達(dá)于 4dpi 后開始迅速下降，于 14dpi 檢測不到，其 e 抗原的表達(dá)于 1dpi 后開始迅速下降，于 21dpi 檢測不到；而慢性 HBV 復(fù)制小鼠血清中表面抗原于 7dpi 上升至最高水平，隨后開始下降，至觀察結(jié)束(25dpi)仍維持在一個(gè)比較高的水平(OD 值平均約為 1)，而其 e 抗原的水平也于 1dpi 開始下降，于 7-21dpi 均維持在一個(gè)比較低的水平，于 25dpi 檢測不到。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，慢性 HBV 復(fù)制組小鼠血清中 HBeAg 的表達(dá)水平(OD450 值)在第一天是明顯低于急性組的，雖然慢性 HBV 復(fù)制模型中 HBeAg 下降早于且快于急性模型，但于 21dpi，急性組所有小鼠 HBeAg 完全檢測不到，但慢性組部分小鼠 HBeAg仍為陽性，雖然表現(xiàn)為低水平表達(dá)，這體現(xiàn)了急、慢性 HBV 復(fù)制模型中 HBeAg 清除速度的不同。這可能與 HBV 高壓尾靜脈模型的不穩(wěn)定性有關(guān)。

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文肝竇內(nèi)皮細(xì)胞可功能成熟并誘導(dǎo) T 細(xì)胞免疫，同時(shí)也顯示出急性和慢性 HBV 復(fù)制小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在調(diào)控 T 細(xì)胞免疫方面存在差異。在 HBV 復(fù)制的晚期，如 21/28dpi，HBV 肝內(nèi)復(fù)制并不能明顯誘導(dǎo)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞功能成熟。在整個(gè) HBV 肝內(nèi)復(fù)制的過程中，，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控 T 細(xì)胞免疫的能力是動(dòng)態(tài)變化的，可于 HBV 復(fù)制 14dpi 功能成熟并誘導(dǎo) T 細(xì)胞免疫，如圖 2-B 所示。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Li He;Aiping Zang;Min Du;Dapeng Ma;Chuanping Yuan;Chun Zhou;Jing Mu;Huanjing Shi;Dapeng Li;Xulin Huang;Qiang Deng;Jianhua Xiao;Huimin Yan;Lijian Hui;Ke Lan;Sidong Xiong;Xiaoxia Li;Zhong Huang;Hui Xiao;;mTOR regulates TLR-induced c-fos and Th1 responses to HBV and HCV vaccines[J];Virologica Sinica;2015年03期

本文編號(hào)：2689771