【摘要】：背景:弓形蟲(Toxoplasma gondii)是屬于原生動(dòng)物頂復(fù)門的一種細(xì)胞內(nèi)專性寄生蟲,有復(fù)雜的生活史,可以在哺乳動(dòng)物包括人類中引起廣泛的傳播。弓形蟲的容許細(xì)胞十分廣泛,能感染幾乎所有的有核細(xì)胞,但其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有著很強(qiáng)的親和力。弓形蟲腦炎是由于潛伏的隱性感染弓形蟲活化為快速增殖的速殖子,進(jìn)而對(duì)腦組織產(chǎn)生損傷。我們之前發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)相關(guān)蛋白R(shí)TN1-C是弓形蟲棒狀體激酶ROP18磷酸化的底物,并且ROP18磷酸化RTN1-C后通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)來促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究中,我們預(yù)測(cè)并證實(shí)了ROP18磷酸化RTN1-C上第7、134位點(diǎn)的絲氨酸(Ser)和第4、8、118位點(diǎn)的蘇氨酸(Thr),磷酸化的RTN1-C能夠抑制組蛋白去乙酰酶(HDAC)活性,促使葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)的乙�；揎�,高乙�；腉RP78使未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的過度活化并導(dǎo)致ERS相關(guān)的凋亡發(fā)生,這可能是弓形蟲腦炎過程中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要機(jī)制。目的:探究弓形蟲ROP18與宿主RTN1-C相互作用參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制,為弓形蟲腦炎的研究提供新的機(jī)制。方法:通過組織染色證明弓形蟲ROP18促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡;通過質(zhì)譜分析、免疫沉淀(IP)、pull-down、細(xì)胞免疫熒光證明ROP18與RTN1-C直接相互作用;通過IP、體外磷酸化實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)分析證明ROP18磷酸化RTN1-C第7、134位點(diǎn)的Ser和第4、8、118位點(diǎn)的Thr;流式細(xì)胞技術(shù)和免疫印跡等證明弓形蟲ROP18通過ERS相關(guān)凋亡通路促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡;HDAC活性檢測(cè)和IP說明ROP18磷酸化RTN1-C抑制HDAC活性,進(jìn)而增強(qiáng)GRP78的乙�；⒋龠M(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果:1.弓形蟲ROP18誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡。(1)HE染色:用環(huán)磷酰胺處理感染Pru株包囊的小鼠,發(fā)現(xiàn)小鼠大腦中Pru株包囊活化,并且活化的Pru株包囊周圍的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生炎癥和壞死。(2)組織免疫熒光:用環(huán)磷酰胺處理感染Pru株包囊的小鼠,發(fā)現(xiàn)與未處理的小鼠相比,給藥處理的小鼠大腦中Pru株包囊活化,且周圍的神經(jīng)細(xì)胞中caspas e-3的活化明顯升高。(3)組織免疫熒光:BALB/c小鼠用以下蟲子感染:過表達(dá)ROP18的RH蟲株(ROP18-WT RH)、過表達(dá)激酶失活型ROP18的RH蟲株(ROP18-KD RH)、敲除ROP18 RH蟲株(Δrop18 RH)和野生型RH速殖子,急性期感染發(fā)病后取小鼠腦組織通過組織免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ROP18-WT RH能明顯增強(qiáng)神經(jīng)元caspase-3的活化。2.證明RTN1-C是ROP18相互作用的宿主蛋白。(1)質(zhì)譜分析:用人類SH-SY5Y細(xì)胞裂解液與純化后的GST-ROP18孵育得到能與ROP18直接相互作用的蛋白,將蛋白條帶切下進(jìn)行質(zhì)譜分析。發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)高表達(dá)的RTN1-C能與ROP18直接相互作用。(2)Pull-down實(shí)驗(yàn):分別將表達(dá)的RTN1-C-FLAG和△20-RTN1-C-FLAG與純化的ROP18-GST進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)ROP18只能與全長的RTN1-C產(chǎn)生相互作用而不能和缺失氨基端20個(gè)氨基酸的RTN1-C相互作用。(3)Co-IP實(shí)驗(yàn):將ROP18-GFP轉(zhuǎn)染到Neuro2a細(xì)胞中用GFP抗體進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)ROP18能與細(xì)胞內(nèi)源性RTN1-C產(chǎn)生相互作用。(4)細(xì)胞免疫熒光:使用過表達(dá)ROP18的ROP18-Ty1 RH蟲株感染Neuro2a細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ROP18能與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性RTN1-C共定位。(5)IP實(shí)驗(yàn),SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞分別感染Δku80ΔhxgprtRH和Δrop18 RH蟲株,用RTN1-C抗體做IP,證明蟲體表達(dá)的ROP18與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的RTN1-C相互作用。3.ROP18磷酸化RTN1-C Ser第7、134和Thr第4、8、118位點(diǎn)。(1)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)ROP18磷酸化RTN1-C第7、134Ser和第4、8、118的Thr位點(diǎn)。(2)IP實(shí)驗(yàn):首先,將RTN1-C-FLAG分別和ROP18-WT-GFP、ROP18-KD-GFP共轉(zhuǎn)染到Neuro2a細(xì)胞中,進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生型ROP18和激酶失活型ROP18均能與RTN1-C相互作用,但是只有野生型ROP18使其磷酸化。其次,將ROP18-GFP分別和RTN1-C-WT、RTN1-C-5A(RTN1-C非磷酸化型突變體,SS7/134AA+TTT4/8/118AAA)同時(shí)轉(zhuǎn)染到Neuro2a細(xì)胞中,進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生型ROP18只能磷酸RTN1-C-WT,而不能磷酸化RTN1-C-5A突變體。最后將ROP18-GFP與△20-RTN1-C共轉(zhuǎn)染到Neuro2a細(xì)胞中進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ROP18不能磷酸化缺失了氨基端20個(gè)氨基酸的RTN1-C。(3)體外磷酸化實(shí)驗(yàn):將RTN1-C-WT和RTN1-C-5A轉(zhuǎn)染到Neuro2a細(xì)胞中,進(jìn)行體外磷酸化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有RTN1-C-WT能被磷酸化,而RTN1-C-5A突變體不能被磷酸化。4.ROP18通過磷酸化RTN1-C介導(dǎo)ERS相關(guān)凋亡通路促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。(1)Neuro2a細(xì)胞經(jīng)caspase-12特異性抑制劑2-ATAD-FMK處理后,分別感染ROP18-WT RH、ROP18-KD RH和野生型RH蟲株。通過免疫印跡發(fā)現(xiàn)ROP18-WT RH促進(jìn)了caspase-12和caspase-3的活化以及CHOP蛋白的表達(dá)。而使用了特異性抑制劑2-ATAD-FMK處理后,能有效降低caspase-12和caspase-3的活化。(2)流式細(xì)胞技術(shù):分別將RTN1-C-WT、RTN1-C-5D和RTN1-C-5A轉(zhuǎn)染到Neuro2a細(xì)胞中,進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè),發(fā)現(xiàn)RTN1-C-WT和RTN1-C-5D促進(jìn)細(xì)胞凋亡,同時(shí)免疫印跡也證明RTN1-C-WT和RTN1-C-5D增加了caspase-12和caspase-3的活化。5.ROP18磷酸化RTN1-C下調(diào)HDAC活性以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。(1)HDAC活性檢測(cè):分別將RTN1-C-WT、RTN1-C-5D和RTN1-C-5A轉(zhuǎn)染到Neuro2a細(xì)胞中,進(jìn)行HDAC活性檢測(cè),發(fā)現(xiàn)RTN1-C-WT和RTN1-C-5D能抑制細(xì)胞中HDAC的活性。(2)IP實(shí)驗(yàn):分別將RTN1-C-WT、RTN1-C-5D和RTN1-C-5A轉(zhuǎn)染到Neuro2a細(xì)胞中,進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了RTN1-C-WT和RTN1-C-5D能使細(xì)胞的HDAC的活性降低和GRP78乙酰化增加,同時(shí)發(fā)現(xiàn)GRP78能與HDAC3相互作用。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光,免疫印跡,流式細(xì)胞技術(shù),IP,pull-down,質(zhì)譜等實(shí)驗(yàn)證明了弓形蟲蛋白R(shí)OP18能與宿主RTN1-C相互作用并使其磷酸化,磷酸化的RTN1-C抑制HDAC3的活性從而增加GRP78乙�；�,通過ERS使神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高,這可能是弓形蟲腦炎過程中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要機(jī)制。
【圖文】：

ROP18激酶活性誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡

34圖 2. ROP18 與 RTN1-C 的相互作用。Fig. 2 ROP18 interacts with RTN1-C. (A) Mass spectrometry screening to identify ROP18 bindingproteins. ROP18-binding proteins were isolated from human SH-SY5Y neuroblastoma cell lineextracts. Silver stained SDS-polyacrylamide gels of control (lane 2) and ROP18-GST pull-downcomplexes (lane 3) are presented. Molecular weight markers are indicated. Bands present in theROP18-GST pull-down were excised (the bands shown), and protein determination was performedby MALDI-TOF mass spectrometry. (B) Confirmation of the binding site of RTN1-C and ROP18 byan in vitro GST pull-down assay. ROP18-GST bound to glutathione beads was used as an affinitymatrix to absorb FLAG-tagged full-length RTN1-C and its truncate △20-RTN1-C expressed
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R531.8

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本文編號(hào)：2679154