【摘要】：背景及目的:2016年全球約170萬人死于結(jié)核病(Tuberculosis,TB),超過因感染人類免疫缺陷病毒(HIV)而死亡的病人人數(shù),結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)作為TB的病原體,再次成為了導(dǎo)致全球人類死亡的主要傳染病因素。近年來,由于耐藥結(jié)核分枝桿菌甚至多重耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)和快速傳播,加之目前卡介苗(BCG)疫苗的保護(hù)力有限,使得TB疫情很難得到有效控制。基因芯片技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)上千萬個(gè)基因的表達(dá),繪制全基因組表達(dá)譜,這一技術(shù)的產(chǎn)生拓展了生物學(xué)的研究方法,極大地推動(dòng)了基因功能的闡明以及基因間相互作用的研究。本研究基于結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染人急性白血病單核細(xì)胞(Human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)源性巨噬細(xì)胞表達(dá)譜芯片,運(yùn)用生物信息學(xué)的分析方法,構(gòu)建H37Rv感染THP-1源性巨噬細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),挖掘出與結(jié)核分枝桿菌感染過程相關(guān)的功能模塊,并篩選出關(guān)鍵基因,對(duì)深入了解結(jié)核病的發(fā)病及宿主防御機(jī)制具有重要意義,并為更有效地診斷與治療結(jié)核病提供了新視角。材料及方法:從NCBI的GEO Datasets數(shù)據(jù)庫中獲取結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染人白血病單核細(xì)胞THP-1源性巨噬細(xì)胞模型的芯片數(shù)據(jù)集,使用R語言的limma包篩選出差異表達(dá)的基因,運(yùn)用DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)對(duì)差異基因進(jìn)行功能注釋分析(GO-Analysis)和信號(hào)通路富集分析(Pathway-Analysis),再整合轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫(Transcriptional Regulatory Element Database,TRED)分析差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子與基因的靶向關(guān)系,構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染THP-1源性巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),進(jìn)一步運(yùn)用DAVID對(duì)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖中的基因和轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factor,TF)進(jìn)行功能注釋分析以及疾病關(guān)聯(lián)分析。進(jìn)一步構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染THP-1源性巨噬細(xì)胞的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?借助形態(tài)學(xué)分析方法、激光共聚焦顯微鏡和ELISA方法等驗(yàn)證模型構(gòu)建成功與否,并通過qRT-PCR驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)中重要節(jié)點(diǎn)基因(CYP19A1)和轉(zhuǎn)錄因子(NFKB1,STAT1,PPARG,CEBPB)的表達(dá)水平,最后對(duì)基因NFKB1,CEBPB和CYP19A1進(jìn)行受試者工作特征曲線(ROC曲線,receiver operator characteristic curve)分析,確定其區(qū)分感染細(xì)胞與未感染細(xì)胞的特異性與靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:本研究收集到2個(gè)基因表達(dá)譜原始數(shù)據(jù)集,利用limma包篩選獲得625個(gè)差異表達(dá)基因,其中427個(gè)基因表達(dá)上調(diào),198個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析,得到在生物過程(Biologocal Process,BP)、細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF)分類中的基因條目分別為179、61和85條,如defense response to virus,response to virus,inflammatory response(BP);cytosol,cytoplasm,nucleoplasm(CC);chemokine activity,protein binding,ATP binding(MF)等。Pathway分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在Influenza A,Herpes simplex infection,NF-kappa B signaling pathway等47個(gè)條目。根據(jù)差異表達(dá)的8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(NFKB1,STAT1,PPARG,CEBPB,E2F2,STAT4,RELB,NFKB2),整合TRED數(shù)據(jù)庫,建立了包含58個(gè)差異基因的轉(zhuǎn)錄因子-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),其中轉(zhuǎn)錄因子NFKB1,STAT1,CEBPB和PPARG調(diào)控了大部分差異表達(dá)基因,網(wǎng)絡(luò)中同時(shí)受三個(gè)以上轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因稱為樞紐基因(Hub Gene),包括CYP19A1,IL6和IRF1,其中CYP19A1是被多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因。進(jìn)一步分析網(wǎng)絡(luò)中58個(gè)基因主要注釋在inflammatory response、immune response、extracellular space、cytosol、protein binding、transcription factor activity,sequence-specific DNA binding等功能上,并與cancer、infection、immune、renal和reproduction等疾病相關(guān)。生物學(xué)驗(yàn)證方面,我們成功建立了結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染THP-1源性巨噬細(xì)胞的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?使用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)中重要節(jié)點(diǎn)基因(CYP19A1)和轉(zhuǎn)錄因子(NFKB1,STAT1,PPARG,CEBPB)的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),除轉(zhuǎn)錄因子STAT1外,基因CYP19A1和轉(zhuǎn)錄因子NFKB1,PPARG,CEBPB均上調(diào)表達(dá),與從芯片數(shù)據(jù)分析出的基因表達(dá)趨勢(shì)結(jié)果相一致,感染組中基因CYP19A1和轉(zhuǎn)錄因子NFKB1,CEBPB的表達(dá)與對(duì)照組相比有顯著差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROC曲線分析NFKB1,CEBPB和CYP19A1發(fā)現(xiàn)曲線下面積(AUC)分別為0.832、0.816和0.710,表明基因能夠較好區(qū)分感染與未感染細(xì)胞。結(jié)論:(1)構(gòu)建了以NFKB1,STAT1,PPARG和CEBPB為主要轉(zhuǎn)錄因子的TF-mRNA基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),呈現(xiàn)出巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌感染過程中基因間相互作用及調(diào)控關(guān)系。(2)成功建立了結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染THP-1源性巨噬細(xì)胞的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?3)報(bào)道基因CYP19A1在巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答結(jié)核分枝桿菌感染過程中的上調(diào)表達(dá)及其在負(fù)調(diào)控巨噬細(xì)胞趨化的潛在功能,為研究巨噬細(xì)胞-結(jié)核分枝桿菌相互作用影響提供新的線索。
【圖文】：

|Log2FC|>1 的數(shù)據(jù)為本研究中的差異表達(dá)基因。圖 2.1 篩選芯片關(guān)鍵詞截圖2.1.2.2 差異表達(dá)基因的聚類分析使用 R 語言 ggplot2 包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析，熱圖可以將差異表達(dá)基因具象化進(jìn)行質(zhì)量控制，然后將基因表達(dá)值進(jìn)行聚類分析。顏色不同表示基因的表達(dá)量不同，紅色代表上調(diào)基因，，顏色越深表示基因表達(dá)值越高，綠色代表下調(diào)基因，顏色越深表示基因表達(dá)值越低。聚類分析代碼見附錄。

第 2 章 結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 感染 THP-1 源性巨噬細(xì)胞模型芯片收集與分析2.2.2 差異表達(dá)基因的的可視化分析使用 R 語言 ggplot2 包對(duì)兩個(gè)芯片共同的 625 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖 2.3（A）所示，0（黃色）代表感染組，1（藍(lán)色）為對(duì)照組，由圖可見，差異表達(dá)的基因可以很好的區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染組和對(duì)照組。用 R語言 ggplot2 包繪制兩個(gè)芯片共同的 625 個(gè)差異基因火山圖，如圖 2.3（B）所示綠色代表下調(diào)大于 2 倍的基因，紅色代表上調(diào)大于 2 倍的基因。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R52

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