【摘要】：【目的】1建立實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,Real-Time qPCR)方法檢測HBV感染者血清前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)水平,評價該方法的性能特點和臨床意義;2監(jiān)測不同臨床結局HBV感染者的血清HBV pgRNA水平,分析血清HBV pgRNA水平與HBV傳統(tǒng)血清學標志物的相關性�！痉椒ā�1建立Real-Time qPCR方法檢測血清中的pgRNA水平1.1 Real-Time qPCR建立設計特異性引物和探針、摸索反應體系和條件、構建質粒標準品、繪制標準曲線等。構建質粒標準品的步驟如下:提取HepG 2.2.15細胞上清液HBV RNA,將其逆轉錄成cDNA,用上下游引物對上述模板進行常規(guī)PCR擴增,PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳驗證為目的片段后進行膠回收、純化,然后與pEASY~?-Blunt載體連接并轉化至Trans1-T1感受態(tài)細胞中。篩選出陽性克隆,經菌落PCR、測序驗證后,增菌抽提質粒。繪制標準曲線的步驟如下:以構建成功的質粒作為標準品,依據公式換算成拷貝數,用Easy Dilution Buffer將上述質粒準確稀釋至1.0×10~(10) copies/ml,再以10倍倍比稀釋得到1×10~(10) copies/ml~1×10~1 copies/ml的10個系列濃度的標準品作為反應模板,采用StepOne plus型熒光定量PCR儀進行定量檢測。以Ct值為縱坐標,不同濃度的對數值為橫坐標繪制標準曲線。1.2 Real-Time qPCR方法學評價用Real-Time qPCR方法對重組質粒標準品(1×10~100 copies/ml~1×10~1copies/ml)進行檢測,評價其線性范圍、靈敏性、特異性、重復性、準確性等。1.3 pgRNA的臨床意義用自建方法檢測不同臨床結局HBV感染者血清的pgRNA水平,監(jiān)測抗病毒藥物對pgRNA水平的影響,從而為患者選擇合適的停藥時機、判斷療效提供參考。2.探討不同臨床結局HBV感染者血清HBV pgRNA水平與HBV傳統(tǒng)血清學標志物的相關性。2.1臨床病例和檢測指標收集就診于福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院就診人群中接受NAs治療的不同臨床結局HBV感染者的血清400例,其中無癥狀乙型肝炎病毒攜帶者(asymptomatic hepatitis b virus carrier,ASC)組、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)組、肝硬化(liver cirrhosis,LC)組和肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)組各100例。HBsAg陰性對照者、其它病毒感染者(包括丙肝患者、EB病毒感染者、單純皰疹感染者)血清共15例。采用磁珠法提取HBV DNA,離心柱法抽提HBV RNA。采用Architect i4000微粒子化學發(fā)光免疫分析儀對HBV血清學標志物HBsAg、HBeAg水平進行定量檢測;通過LightCycler 480熒光定量PCR儀對HBV DNA水平進行定量檢測;采用StepOne plus型熒光定量PCR儀對血清HBV pgRNA水平進行定量檢測。2.2相關性分析分析HBV感染者血清HBV pgRNA水平與HBV傳統(tǒng)血清學標志物的相關性,比較不同臨床結局HBV感染者中ASC組、CHB組、LC組和HCC組兩兩之間其血清HBV pgRNA水平和HBV傳統(tǒng)血清學標志物差異,從而為臨床抗病毒治療提供參考。【結果】1建立Real-Time qPCR方法檢測血清中的pgRNA水平1.1成功建立Real-Time qPCR確定了該方法的反應條件;成功構建了質粒標準品以及繪制了標準曲線。1.2 Real-Time qPCR方法學評價Real-Time qPCR方法檢測標準質粒的線性范圍為1×10~100 copies/ml~1×10~3copies/ml;檢測下限為1×10~3 copies/ml;批內變異系數在0.13%~0.73%之間;批間變異系數在0.16%~0.63%之間;該方法檢測其它病毒感染者的血清HBV pgRNA水平均為陰性,說明該方法具有較好的特異性;用于評價該方法準確度的回收試驗的平均回收率為93.785%,符合《中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標準》的規(guī)定。1.3 pgRNA的臨床意義用Real-Time qPCR方法檢測不同臨床結局HBV感染者的血清HBV pgRNA水平,同HBV DNA、HBsAg水平比較,分析結果發(fā)現,HBV pgRNA水平在ASC組和LC組、ASC組和HCC組、CHB組和LC組、CHB組和HCC組中均具有顯著差異{[(4.32±2.36)copies/ml]vs.[(3.22±2.13)copies/ml],[(4.32±2.36)copies/ml]vs.[(3.14±2.12)copies/ml],[(4.41±2.51)copies/ml]vs.[(3.22±2.13)copies/ml],[(4.41±2.51)copies/ml]vs.[(3.14±2.12)copies/ml],均P0.05};HBV DNA水平在ASC組和LC組、ASC組和HCC組、CHB組和LC組、CHB組和HCC組中均具有顯著差異{[(4.42±1.72)copies/ml]vs.[(3.68±0.89)copies/ml],[(4.42±1.72)copies/ml]vs.[(3.64±0.65)copies/ml],[(4.7±1.77)copies/ml]vs.[(3.68±0.89)copies/ml],[(4.7±1.77)copies/ml]vs.[(3.64±0.65)copies/ml],均P0.05};HBsAg水平在ASC組和LC組、ASC組和HCC組、CHB組和LC組、CHB組和HCC組中均具有顯著差異{[(7393.32±16302.77)IU/ml]vs.[(1831.56±6005.84)IU/ml],[(7393.32±16302.77)IU/ml]vs.[1276.72±1697.07)IU/ml],[6157.9±11583.95)IU/ml]vs.[(1831.56±6005.84)IU/ml],[6157.9±11583.95)IU/ml]vs.[1276.72±1697.07)IU/ml],均P0.05},提示在區(qū)別不同臨床結局HBV感染者方面HBV pgRNA類比HBV傳統(tǒng)血清學標志物有相似的臨床意義。2探討不同臨床結局HBV感染者血清HBV pgRNA水平與HBV傳統(tǒng)血清學標志物的相關性收集接受NAs治療的不同臨床結局HBV感染者的血清400例,其中ASC組、CHB組、LC組和HCC組各100例。分析400例HBV感染者不同血清學指標HBV DNA、HBV pgRNA、HBsAg水平兩兩之間的相關性,發(fā)現HBV pgRNA水平和HBV DNA水平的相關性(r=0.58,P0.001)相較于和HBsAg水平的相關性(r=0.47,P0.001)良好,HBsAg水平和HBV DNA水平的相關性(r=0.45,P0.001)良好。另外,我們還分別研究了HBeAg陽性和HBeAg陰性患者中HBV pgRNA水平與HBV傳統(tǒng)血清學標志物的相關性。結果發(fā)現HBV pgRNA水平和HBV DNA水平在HBeAg陽性組{[(5.04±2.49)copies/ml],[(4.85±1.97)copies/ml]}中均高于HBeAg陰性組{[(3.11±1.99)copies/ml],[(3.72±0.91)copies/ml]},差異顯著(t=9.987,P0.001;t=7.545,P0.001)。HBV pgRNA和HBV DNA水平在HBeAg陽性組(r=0.57,P0.001)和HBeAg陰性組(r=0.32,P0.001)中均呈正相關,但前者相關性較后者良好。此外,我們對400例HBV感染者不同血清學指標統(tǒng)計分析發(fā)現,HBV DNA500 IU/ml的標本中HBV pgRNA的檢出率是78.9%,提示HBV DNA水平的高低和HBV pgRNA檢出率是否有某種關聯呢?進而我們從這些標本中選取了108例HBV DNA500 IU/ml的標本,依據HBV DNA水平再細分為HBV DNA20 IU/ml組(74例)和20 IU/mlHBV DNA500 IU/ml組(34例),分析統(tǒng)計HBV pgRNA的檢出率,兩組檢出率分別是17.57%(13/74)和41.18%(14/34),即在HBV DNA20 IU/ml組(74例)中82.43%(61/74)的HBV感染者的HBV DNA水平和HBV pgRNA水平皆低于檢測下限�！窘Y論】1成功建立定量檢測HBV感染者血清HBV pgRNA水平的Real-Time qPCR方法。該方法具有較好的準確性、敏感性、特異性和較寬的線性范圍,適合于臨床實驗室推廣應用。2 HBV pgRNA水平與HBV DNA、HBsAg水平均具有良好的相關性;通過監(jiān)測不同臨床結局HBV感染者HBV pgRNA水平與HBV傳統(tǒng)血清學標志物水平的動態(tài)變化,以了解HBV的感染狀態(tài)、評價抗病毒治療效果,有望為不同臨床結局HBV感染者進展的判斷提供新的、潛在的預測指標之一。
【圖文】：

健康的肝細胞再次被感染[14,20]（圖 1）。已有研究證實，細胞內最關鍵的復制中間體是 HBV cccDNA 分子，該分子是 HBV 持續(xù)感染的關鍵因素，患者肝細胞中只要仍殘留有HBVcccDNA,當病毒抑制狀態(tài)被解除后就有可能再次引起病毒的復制活躍，因此，CHB 患者停用抗病毒藥物后發(fā)生病毒學反彈和疾病復發(fā)的最主要原因是殘留在肝細胞內的 HBV cccDNA 分子[21]。

較非正態(tài)分布的變量。相關性程度差異有統(tǒng)計學意義。結 果構建的序列進行擴增，擴增結束后取 1電泳 40 min 后，電泳結束后將察實驗結果（圖 1.1）。1 泳道和設計的目的片段長度一致。
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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本文編號：2670688