【摘要】：【目的】1建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,Real-Time qPCR)方法檢測(cè)HBV感染者血清前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)水平,評(píng)價(jià)該方法的性能特點(diǎn)和臨床意義;2監(jiān)測(cè)不同臨床結(jié)局HBV感染者的血清HBV pgRNA水平,分析血清HBV pgRNA水平與HBV傳統(tǒng)血清學(xué)標(biāo)志物的相關(guān)性。【方法】1建立Real-Time qPCR方法檢測(cè)血清中的pgRNA水平1.1 Real-Time qPCR建立設(shè)計(jì)特異性引物和探針、摸索反應(yīng)體系和條件、構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)等。構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的步驟如下:提取HepG 2.2.15細(xì)胞上清液HBV RNA,將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用上下游引物對(duì)上述模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證為目的片段后進(jìn)行膠回收、純化,然后與pEASY~?-Blunt載體連接并轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。篩選出陽(yáng)性克隆,經(jīng)菌落PCR、測(cè)序驗(yàn)證后,增菌抽提質(zhì)粒。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的步驟如下:以構(gòu)建成功的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,依據(jù)公式換算成拷貝數(shù),用Easy Dilution Buffer將上述質(zhì)粒準(zhǔn)確稀釋至1.0×10~(10) copies/ml,再以10倍倍比稀釋得到1×10~(10) copies/ml~1×10~1 copies/ml的10個(gè)系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為反應(yīng)模板,采用StepOne plus型熒光定量PCR儀進(jìn)行定量檢測(cè)。以Ct值為縱坐標(biāo),不同濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。1.2 Real-Time qPCR方法學(xué)評(píng)價(jià)用Real-Time qPCR方法對(duì)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(1×10~100 copies/ml~1×10~1copies/ml)進(jìn)行檢測(cè),評(píng)價(jià)其線(xiàn)性范圍、靈敏性、特異性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性等。1.3 pgRNA的臨床意義用自建方法檢測(cè)不同臨床結(jié)局HBV感染者血清的pgRNA水平,監(jiān)測(cè)抗病毒藥物對(duì)pgRNA水平的影響,從而為患者選擇合適的停藥時(shí)機(jī)、判斷療效提供參考。2.探討不同臨床結(jié)局HBV感染者血清HBV pgRNA水平與HBV傳統(tǒng)血清學(xué)標(biāo)志物的相關(guān)性。2.1臨床病例和檢測(cè)指標(biāo)收集就診于福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診人群中接受NAs治療的不同臨床結(jié)局HBV感染者的血清400例,其中無(wú)癥狀乙型肝炎病毒攜帶者(asymptomatic hepatitis b virus carrier,ASC)組、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)組、肝硬化(liver cirrhosis,LC)組和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)組各100例。HBsAg陰性對(duì)照者、其它病毒感染者(包括丙肝患者、EB病毒感染者、單純皰疹感染者)血清共15例。采用磁珠法提取HBV DNA,離心柱法抽提HBV RNA。采用Architect i4000微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)HBV血清學(xué)標(biāo)志物HBsAg、HBeAg水平進(jìn)行定量檢測(cè);通過(guò)LightCycler 480熒光定量PCR儀對(duì)HBV DNA水平進(jìn)行定量檢測(cè);采用StepOne plus型熒光定量PCR儀對(duì)血清HBV pgRNA水平進(jìn)行定量檢測(cè)。2.2相關(guān)性分析分析HBV感染者血清HBV pgRNA水平與HBV傳統(tǒng)血清學(xué)標(biāo)志物的相關(guān)性,比較不同臨床結(jié)局HBV感染者中ASC組、CHB組、LC組和HCC組兩兩之間其血清HBV pgRNA水平和HBV傳統(tǒng)血清學(xué)標(biāo)志物差異,從而為臨床抗病毒治療提供參考�！窘Y(jié)果】1建立Real-Time qPCR方法檢測(cè)血清中的pgRNA水平1.1成功建立Real-Time qPCR確定了該方法的反應(yīng)條件;成功構(gòu)建了質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以及繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。1.2 Real-Time qPCR方法學(xué)評(píng)價(jià)Real-Time qPCR方法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的線(xiàn)性范圍為1×10~100 copies/ml~1×10~3copies/ml;檢測(cè)下限為1×10~3 copies/ml;批內(nèi)變異系數(shù)在0.13%~0.73%之間;批間變異系數(shù)在0.16%~0.63%之間;該方法檢測(cè)其它病毒感染者的血清HBV pgRNA水平均為陰性,說(shuō)明該方法具有較好的特異性;用于評(píng)價(jià)該方法準(zhǔn)確度的回收試驗(yàn)的平均回收率為93.785%,符合《中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定。1.3 pgRNA的臨床意義用Real-Time qPCR方法檢測(cè)不同臨床結(jié)局HBV感染者的血清HBV pgRNA水平,同HBV DNA、HBsAg水平比較,分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),HBV pgRNA水平在ASC組和LC組、ASC組和HCC組、CHB組和LC組、CHB組和HCC組中均具有顯著差異{[(4.32±2.36)copies/ml]vs.[(3.22±2.13)copies/ml],[(4.32±2.36)copies/ml]vs.[(3.14±2.12)copies/ml],[(4.41±2.51)copies/ml]vs.[(3.22±2.13)copies/ml],[(4.41±2.51)copies/ml]vs.[(3.14±2.12)copies/ml],均P0.05};HBV DNA水平在ASC組和LC組、ASC組和HCC組、CHB組和LC組、CHB組和HCC組中均具有顯著差異{[(4.42±1.72)copies/ml]vs.[(3.68±0.89)copies/ml],[(4.42±1.72)copies/ml]vs.[(3.64±0.65)copies/ml],[(4.7±1.77)copies/ml]vs.[(3.68±0.89)copies/ml],[(4.7±1.77)copies/ml]vs.[(3.64±0.65)copies/ml],均P0.05};HBsAg水平在ASC組和LC組、ASC組和HCC組、CHB組和LC組、CHB組和HCC組中均具有顯著差異{[(7393.32±16302.77)IU/ml]vs.[(1831.56±6005.84)IU/ml],[(7393.32±16302.77)IU/ml]vs.[1276.72±1697.07)IU/ml],[6157.9±11583.95)IU/ml]vs.[(1831.56±6005.84)IU/ml],[6157.9±11583.95)IU/ml]vs.[1276.72±1697.07)IU/ml],均P0.05},提示在區(qū)別不同臨床結(jié)局HBV感染者方面HBV pgRNA類(lèi)比HBV傳統(tǒng)血清學(xué)標(biāo)志物有相似的臨床意義。2探討不同臨床結(jié)局HBV感染者血清HBV pgRNA水平與HBV傳統(tǒng)血清學(xué)標(biāo)志物的相關(guān)性收集接受NAs治療的不同臨床結(jié)局HBV感染者的血清400例,其中ASC組、CHB組、LC組和HCC組各100例。分析400例HBV感染者不同血清學(xué)指標(biāo)HBV DNA、HBV pgRNA、HBsAg水平兩兩之間的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)HBV pgRNA水平和HBV DNA水平的相關(guān)性(r=0.58,P0.001)相較于和HBsAg水平的相關(guān)性(r=0.47,P0.001)良好,HBsAg水平和HBV DNA水平的相關(guān)性(r=0.45,P0.001)良好。另外,我們還分別研究了HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性患者中HBV pgRNA水平與HBV傳統(tǒng)血清學(xué)標(biāo)志物的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV pgRNA水平和HBV DNA水平在HBeAg陽(yáng)性組{[(5.04±2.49)copies/ml],[(4.85±1.97)copies/ml]}中均高于HBeAg陰性組{[(3.11±1.99)copies/ml],[(3.72±0.91)copies/ml]},差異顯著(t=9.987,P0.001;t=7.545,P0.001)。HBV pgRNA和HBV DNA水平在HBeAg陽(yáng)性組(r=0.57,P0.001)和HBeAg陰性組(r=0.32,P0.001)中均呈正相關(guān),但前者相關(guān)性較后者良好。此外,我們對(duì)400例HBV感染者不同血清學(xué)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),HBV DNA500 IU/ml的標(biāo)本中HBV pgRNA的檢出率是78.9%,提示HBV DNA水平的高低和HBV pgRNA檢出率是否有某種關(guān)聯(lián)呢?進(jìn)而我們從這些標(biāo)本中選取了108例HBV DNA500 IU/ml的標(biāo)本,依據(jù)HBV DNA水平再細(xì)分為HBV DNA20 IU/ml組(74例)和20 IU/mlHBV DNA500 IU/ml組(34例),分析統(tǒng)計(jì)HBV pgRNA的檢出率,兩組檢出率分別是17.57%(13/74)和41.18%(14/34),即在HBV DNA20 IU/ml組(74例)中82.43%(61/74)的HBV感染者的HBV DNA水平和HBV pgRNA水平皆低于檢測(cè)下限。【結(jié)論】1成功建立定量檢測(cè)HBV感染者血清HBV pgRNA水平的Real-Time qPCR方法。該方法具有較好的準(zhǔn)確性、敏感性、特異性和較寬的線(xiàn)性范圍,適合于臨床實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。2 HBV pgRNA水平與HBV DNA、HBsAg水平均具有良好的相關(guān)性;通過(guò)監(jiān)測(cè)不同臨床結(jié)局HBV感染者HBV pgRNA水平與HBV傳統(tǒng)血清學(xué)標(biāo)志物水平的動(dòng)態(tài)變化,以了解HBV的感染狀態(tài)、評(píng)價(jià)抗病毒治療效果,有望為不同臨床結(jié)局HBV感染者進(jìn)展的判斷提供新的、潛在的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一。
【圖文】：

健康的肝細(xì)胞再次被感染[14,20]（圖 1）。已有研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)最關(guān)鍵的復(fù)制中間體是 HBV cccDNA 分子，該分子是 HBV 持續(xù)感染的關(guān)鍵因素，患者肝細(xì)胞中只要仍殘留有HBVcccDNA,當(dāng)病毒抑制狀態(tài)被解除后就有可能再次引起病毒的復(fù)制活躍，因此，CHB 患者停用抗病毒藥物后發(fā)生病毒學(xué)反彈和疾病復(fù)發(fā)的最主要原因是殘留在肝細(xì)胞內(nèi)的 HBV cccDNA 分子[21]。

較非正態(tài)分布的變量。相關(guān)性程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié) 果構(gòu)建的序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后取 1電泳 40 min 后，電泳結(jié)束后將察實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖 1.1）。1 泳道和設(shè)計(jì)的目的片段長(zhǎng)度一致。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2670688