【摘要】：目的通過在人群研究中分析抗結(jié)核藥物性肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced liver injury,ADLI)患者和非患者抗凝血標(biāo)本中GRP78的表達(dá)水平及其與肝功指標(biāo)ALT、AST的相關(guān)性,并在細(xì)胞中予以驗(yàn)證,探討ADLI中組蛋白乙酰化對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的調(diào)控作用。方法本課題從人群和細(xì)胞兩個方面進(jìn)行研究。1人群研究:對2016年7月至2016年12月在唐山市第四醫(yī)院被診斷為結(jié)核病的住院患者的基本情況和抗凝血標(biāo)本進(jìn)行收集。將符合條件的63例患者納入肝損傷組,在非肝損傷患者中進(jìn)行成組匹配,選擇與肝損傷組相匹配的63名患者作為非肝損傷組。ELISA法檢測患者血漿中GRP78表達(dá)水平。利用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,比較肝損傷組和非肝損傷組患者GRP78表達(dá)差異,并采用Pearson相關(guān)進(jìn)行GRP78與ALT、AST的相關(guān)性分析。2細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn):首先將抗結(jié)核藥物分為五個加藥組,即INH組、RFP組、PZA組、兩藥組和三藥組,CCK8法確定最佳濃度后通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)及肝功指標(biāo)水平確定肝損傷造模成功;其次,利用CCK8法檢測不同濃度的C646和MS-275對HL-7702肝細(xì)胞的毒性作用,確定兩者的最佳濃度;最后,將每個加藥組又分為對照組、藥物組、C646組、藥物+C646組、MS-275組、藥物+MS-275組,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針標(biāo)記后觀察各藥物組細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)狀態(tài),RT-PCR法檢測各藥物組細(xì)胞中P300、HDAC1、GRP78、CHOP的m RNA相對表達(dá)量,Western Blot方法檢測各藥物組細(xì)胞中P300、HDAC1、GRP78、CHOP的蛋白含量;微孔板法檢測各藥物組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST的表達(dá)水平;Annexin V/PI雙染法檢測各藥物組細(xì)胞凋亡率水平。結(jié)果本研究結(jié)果分為兩部分。1人群研究結(jié)果:與非肝損傷組相比,肝損傷組血漿中GRP78表達(dá)明顯升高(P0.05),且GRP78與ALT、AST均呈明顯正相關(guān)(r=0.468,0.386,均P0.05)。2細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與對照組相比,各藥物組中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光均明顯減弱,胞漿濃縮,HDAC1、GRP78、CHOP m RNA和蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào)(P0.05),P300 m RNA和蛋白含量均明顯降低(P0.05),細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST表達(dá)水平明顯升高(P0.05)且細(xì)胞凋亡率上升明顯(P0.05);與藥物組相比,各藥物+C646組細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光強(qiáng)度變化不明顯,HDAC1變化亦不明顯,P300、GRP78 m RNA和蛋白含量則明顯降低(P0.05),但CHOP表達(dá)量顯著升高(P0.05),細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST水平及細(xì)胞凋亡率再次升高(P0.05);但各藥物+MS-275組HDAC1、CHOP m RNA和蛋白水平明顯降低(P0.05),GRP78表達(dá)顯著升高(P0.05),但P300變化不明顯,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光強(qiáng)度減弱更加明顯,細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST水平及細(xì)胞凋亡率有所降低(P0.05)。結(jié)論1 ADLI患者血漿中GRP78表達(dá)明顯上調(diào),且GRP78含量與ALT、AST呈正相關(guān),在人群中初步證實(shí)ERS與ADLI有關(guān)。2在細(xì)胞中驗(yàn)證ADLI進(jìn)程中伴隨組蛋白乙�；癄顟B(tài)的改變和ERS的發(fā)生,且進(jìn)一步證實(shí)組蛋白乙�；降母淖儏⑴c調(diào)控ERS,進(jìn)而影響肝細(xì)胞損傷及凋亡。
【圖文】：

表 6 不同濃度抗結(jié)核藥物處理后細(xì)胞的相對存活率le 6 Relative survival rate of cells in different kinds of anti-tuberculosis藥物 藥物濃度 μg/ml 細(xì)胞相對存活率（%）異煙肼組 1000 83.68利福平組 100 82.97吡嗪酰胺組 500 81.10兩藥組 120+240 83.84三藥組 75+150+400 83.80結(jié)核藥物可使肝細(xì)胞發(fā)生損傷）HE 染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察各加藥組肝細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果如細(xì)胞形態(tài)正常，呈梭形或多邊形，核大而圓，，位于細(xì)胞正中，胞物組肝細(xì)胞數(shù)量較少，形態(tài)趨于扁圓，胞質(zhì)皺縮，其中兩藥組和最明顯，三藥組胞質(zhì)皺縮最嚴(yán)重，甚至無法觀察到胞質(zhì)，且各藥融合的現(xiàn)象。

第 2 章 實(shí)驗(yàn)研究（2）肝功檢測指標(biāo) ALT 和 AST 在臨床上使用頻繁，兩指標(biāo)的檢測結(jié)果有助于增進(jìn)對肝臟功能的認(rèn)識及診斷。本研究不僅對 HL-7702 細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察，還檢測了各藥物組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 ALT、AST 的表達(dá)水平。由圖 2 可知，各藥物組與對照組相比，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 ALT、AST 表達(dá)水平均明顯升高（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中三藥組中 ALT、AST 上調(diào)最明顯，兩藥組僅次于三藥組，說明該組抗結(jié)核藥對細(xì)胞損傷程度最嚴(yán)重。以上細(xì)胞形態(tài)學(xué)和肝功指標(biāo)結(jié)果均表明，抗結(jié)核藥物致肝細(xì)胞損傷模型建立成功。
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R52;R575

【參考文獻(xiàn)】

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1 婁利霞,唐朝樞;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與心血管疾病[J];中國分子心臟病學(xué)雜志;2005年02期

本文編號：2665897