【摘要】：目的:研究白念珠菌線粒體缺陷株感染小鼠腸道的毒力和免疫差異及對腸道正常菌群微生態(tài)的影響。方法:小鼠隨機分成5組(每組10只):A組、B組、C組、D組及E組。灌胃前統(tǒng)一喂養(yǎng)抗生素(四環(huán)素、鏈霉素、慶大霉素)溶液3天,A組給予白念珠菌標準菌株5314菌懸液灌胃,B組予等量白念珠菌缺陷菌株goa31菌懸液灌胃,C組予缺陷菌株nuo1菌懸液灌胃、D組予缺陷菌株nuo2菌懸液灌胃、E組予缺陷菌株ndh51菌懸液灌胃,構(gòu)建小鼠腸道白念珠菌感染模型。灌胃期間持續(xù)予抗生素水喂養(yǎng),灌胃后第1天、3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天后分別取糞便進行涂板計數(shù)。在灌胃后第1天,第3天,第7天,第15天頸椎脫臼處死小鼠,留取結(jié)腸組織,通過組織病理切片及實時熒光定量PCR比較各組腸道的組織病理學改變和炎癥。腸道微生態(tài)實驗分組及灌胃同上,喂養(yǎng)無菌水,灌胃后第1天及每隔兩天收集小鼠糞便,提取RNA做16srRNA基因高通量測序,檢測白念珠菌標準株及線粒體缺陷株對腸道菌群微生態(tài)的影響。結(jié)果:(1)糞便菌落計數(shù):A組(5314)D組(nuo2)C組(nuo1)B組(goa31)E組(ndh51),野生株峰值與四組缺陷株菌落計數(shù)峰值出現(xiàn)在第6天,與野生菌株組峰值相差10^2以上(P0.05),菌落計數(shù)隨著時間增加而逐漸減少,其中B組與E組第9天后糞便培養(yǎng)未見白念珠菌生長。(2)實時熒光定量PCR:和空白組(NC組)對比,A組小鼠腸粘膜炎癥因子如IL-17、IFN-y、IL-22和TNF在白念珠菌5314感染一周后都出現(xiàn)顯著性增加(P0.05),而在B、C、D、E四組缺陷菌中沒有顯著性變化。(3)組織病理:HE染色顯示,A組小鼠腸粘膜淋巴細胞浸潤顯著性增多、腸絨毛破壞,而其余四組缺陷菌株小鼠腸粘膜基本沒有炎癥細胞浸潤。PAS染色顯示,A組小鼠腸道粘膜層可見較多假菌絲、孢子,部分菌絲嵌入腸道上皮細胞內(nèi);而其余四組缺陷菌小鼠腸道粘膜未見假菌絲及孢子。(4)腸道微生態(tài)結(jié)果:小鼠結(jié)腸微生物豐度最大的菌群是擬桿菌門、厚壁菌門,與灌胃前對比,灌胃后第三天Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)增加明顯,有4個類菌群相對豐度在D3組小鼠結(jié)腸微生物菌群中顯著增加,分別是Alistipesspp.,Bacteroides_acidifaciens spp,Bacteroidaceae spp,Bacteroides spp.結(jié)論:1.本實驗我們初步證實,與野生株相比,四種缺陷株感染腸道能力明顯下降,且表現(xiàn)為nuo2nuo1ndh51goa31,提示在感染腸道過程中,白念珠菌四種缺陷株由于線粒體功能缺陷引起的菌絲形成能力、毒力及代謝的變化,從而導致感染小鼠腸道的能力明顯下降,且菌絲形成相對菌株結(jié)構(gòu)或代謝變化對菌株毒力及腸道免疫的影響更大。2.灌胃白念珠菌后,腸道菌群豐度升高,但引起腸道微生態(tài)的改變是暫時的,腸道菌群微生態(tài)平衡在灌胃結(jié)束兩周后恢復正常,且起重要作用的菌群可能是擬桿菌。
【圖文】：

■■逡逑圖２－１涂板菌落生長圖逡逑圖２－１邋Ｆ：灌胃前；Ａ：Ａ組（灌胃白念５３１４）小鼠糞便培養(yǎng)平板；Ｃ：邋Ｂ組（灌胃白念ｇｏａ３１）小鼠糞便培養(yǎng)逡逑平板：Ｄ：Ｃ組（灌胃白念ｍｉ0ｌ＞小鼠糞便培養(yǎng)平板：Ｅ：邋Ｄ組（灌胃白念ｎｕ0２）小鼠糞便培養(yǎng)平板：Ｆ：邋Ｅ組（灌逡逑胃白念ｎｄｈ５１）小鼠糞便培養(yǎng)平板。逡逑２．６．２四種缺陷株與野生株糞便菌落計數(shù)差異逡逑裴便菌落計數(shù)示：Ａ邋組（５３１４）邋＞０組邋Ｃｎｕｏ２）邋＞（３組（ｎｕｏｌ）邋＞８組邋Ｃｇｏａ３１）邋＞Ｅ逡逑組（ｎｄｈ５１），，菌落計數(shù)用均值＋方差表示，野生株與四組缺陷株峰值出現(xiàn)在第６天，逡逑缺陷株與野生菌株組峰值相差１０Ａ２以上（Ｐ＜０．０５），菌落計數(shù)隨著時間增加而逐漸減逡逑少，其中Ｂ組與Ｅ組第９天后糞便培養(yǎng)未見白念珠菌生長，詳見表格２－１。逡逑１４逡逑

圖２－２不同組別小鼠糞便菌量計數(shù)與時間變化折線圖逡逑２．６．３實時熒光定量ＰＣＲ檢測小鼠腸道粘膜炎癥因子變化情況逡逑五組小鼠腸粘膜炎癥因子在轉(zhuǎn)錄水平的變化如圖２－３所示。和空白組（ＮＣ組）對逡逑比，Ａ組小鼠腸粘膜炎癥因子如ＩＬ－１７（Ａ）、ＩＦＮ－Ｙ（Ｂ）、ＩＬ－２２邋（Ｃ）和ＴＮＦ邋（Ｄ）在逡逑白念珠菌５３１４感染一周后都出現(xiàn)顯著性增加（Ｐ＜０．０５），而在Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ四組缺陷逡逑菌中沒有顯著性變化，表明白念珠菌５３１４感染一周后引起了小鼠腸粘膜炎癥反應，逡逑但灌胃四種缺陷菌株一周對小鼠腸粘膜免疫反應無明顯影響。逡逑１５逡逑
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R519.3

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