【摘要】：目的:乙型肝炎病毒是以逆轉(zhuǎn)錄方式進行復(fù)制的嗜肝DNA病毒。MOV10是宿主細胞重要的抗病毒因子,MOV10不僅抑制多種病毒復(fù)制,包括人類免疫缺陷病毒1型,丙型肝炎病毒、甲型流感病毒和水皰性口炎病毒,還限制了反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LINE-1,Alu,SVA的活性。然而MOV10是否可以抑制HBV復(fù)制及相關(guān)機制尚未報道。因此,本文重點研究宿主限制性因子MOV10對HBV復(fù)制的調(diào)控作用,初步闡明MOV10抑制HBV的機制。方法:(1)MOV10抑制HBV復(fù)制的表型研究:我們在慢乙肝患者的臨床樣本和HBV復(fù)制的細胞中檢測了MOV10表達與HBV復(fù)制的關(guān)系:比較健康人和慢性乙肝感染患者外周血單個核細胞中MOV10的表達差異,在HBV穩(wěn)定表達細胞HepAD38檢測MOV10蛋白表達與病毒復(fù)制的關(guān)系,探討MOV10和HBV復(fù)制的相關(guān)性;Huh7和HepG2-NTCP細胞通過siRNA干擾內(nèi)源性MOV10,提取胞質(zhì)中的病毒RNA和病毒核心顆粒的DNA,通過Southern blot,q-PCR、Northern blot檢測病毒復(fù)制水平的變化,通過native gel檢測病毒核心顆粒的變化;在Huh7和HepG2-NTCP中過表達MOV10,提取病毒顆粒DNA和RNA,通過Southern blot、Northern blot檢測病毒復(fù)制水平的變化。(2)MOV10抑制HBV復(fù)制的機制研究:檢測MOV10是否通過HBV啟動子發(fā)揮抑制作用;IFN-α和IFN-γ刺激Huh7細胞,提取細胞RNA和蛋白檢測MOV10的表達水平,探討MOV10是否作為干擾素誘導(dǎo)基因發(fā)揮抗病毒作用;在Huh7中通過siRNA干擾干擾素上游基因IRF3和干擾素下游基因STAT1,共轉(zhuǎn)染HBV和MOV10,熒光定量PCR分析病毒DNA水平的變化,探討MOV10是否通過調(diào)控干擾素應(yīng)答通路發(fā)揮抗病毒作用;構(gòu)建MOV10解旋酶的保守結(jié)構(gòu)域Ⅱ的酶活突變體(D645A、E646Q和G648A),檢測酶活突變后對MOV10抗病毒作用的影響;探討MOV10是否通過與病毒蛋白或病毒RNAs結(jié)合發(fā)揮抗病毒作用:HEK293細胞中共轉(zhuǎn)染HBV復(fù)制質(zhì)粒和MOV10表達質(zhì)粒,免疫共沉淀試驗檢測MOV10是否和病毒核心蛋白HBc相互作用;在HEK293細胞中共轉(zhuǎn)染HBV復(fù)制質(zhì)粒和MOV10表達質(zhì)粒,通過RNA-IP研究MOV10與HBV RNA的結(jié)合,探討MOV10是否通過與病毒RNAs發(fā)揮抗病毒作用。結(jié)果:慢性乙肝感染患者外周血單個核細胞中MOV10表達水平低于健康人外周血MOV10水平;在HBV穩(wěn)定復(fù)制的細胞系HepAD38中,去除四環(huán)素啟動病毒復(fù)制后,MOV10蛋白水平下降,說明MOV10與HBV復(fù)制相關(guān);Huh7中干擾內(nèi)源性MOV10后,HBV DNA復(fù)制水平升高1.5倍,而病毒RNA和病毒Capsid無明顯變化,在基于HepG2-NTCP的HBV感染模型中,干擾后病毒DNA水平增加1.5倍;Huh7細胞中過表達外源性的MOV10,顯著抑制了HBV DNA的復(fù)制,而病毒RNA無明顯變化,表明MOV10抑制病毒復(fù)制主要發(fā)生在DNA復(fù)制環(huán)節(jié),同樣在HepG2-NTCP的HBV感染模型中,過表達外源性的MOV10顯著抑制病毒DNA的復(fù)制;在機制解析方面:MOV10不通過HBV啟動子發(fā)揮作用;在肝癌細胞中,MOV10不受IFN-α和IFN-γ誘導(dǎo)發(fā)揮抗病毒作用;同樣在肝癌細胞中,干擾干擾素通路上游基因IRF3和干擾素下游基因STAT1,MOV10的抗病毒作用沒有顯著消失,表明MOV10不通過干擾素通路發(fā)揮抗病毒作用;MOV10結(jié)構(gòu)域Ⅱ突變體同樣顯著抑制HBV的復(fù)制,表明MOV10不依賴其解旋酶活性抑制HBV復(fù)制;通過RNA-IP實驗,初步表明MOV10可以與HBV RNAs結(jié)合,進一步通過多重RT-PCR證明MOV10與3.5kb的pgRNA結(jié)合,這種結(jié)合可能是MOV10發(fā)揮抗病毒作用的關(guān)鍵。結(jié)論:在肝癌細胞中,宿主限制性因子MOV10的表達與HBV復(fù)制相關(guān),其抑制HBV復(fù)制不通過作用于病毒的啟動子,不依賴于其解旋酶活性,也不是作為干擾素誘導(dǎo)基因或促進干擾素通路發(fā)揮抗病毒作用來抑制病毒復(fù)制,其機制可能與HBV RNA結(jié)合有關(guān)。
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文Huh7 cellss in suspension were transfected with 50 nM and 100 nM siRNA targeting MOV10 oting siRNA control (NT). The cells were plated and further transfected with HBVn plasmid, then the effect of knockdown MOV10 by siRNA were measured by Weste viral RNA were detected by Northern blot (NB) (b), the viral DNA (c) and Capsidcted by q-PCR and Native gel.驗證干擾內(nèi)源性 MOV10 可以促進 HBV 復(fù)制，我們在 HepG2-NTC染細胞模型上干擾內(nèi)源表達的 MOV10，然后感染 HBV 病毒顆粒，，4復(fù)制中間體，q-PCR 檢測病毒 DNA 水平，結(jié)果表明在 HepG2-NTCPMOV10 后，病毒 DNA 水平增加 1.5 倍（圖 2.2.2）。

圖 2.3.1 Huh7 細胞中過表達外源性的 MOV10 抑制 HBV 復(fù)制Fig2.3.1 Overexpression of MOV10 decreased HBV DNAlevels in Huh7 cellsHBV plasimid or pcDNA3.1(CTL) and MOV10 expression plasmids were co-transfected intoHuh7 cells , then HBV RNA and HBV core-associated DNA levels in cell cytoplasm weredetermined by Northern blot and Southern blot, respectively. The expressions of MOV10 weredeternminded by Western blot. The effect of MOV10 on cell proliferation was tested by MTTassays a). The effect of MOV10 on HBV DNA levels measured by Southern blot. b). Theexpressions of MOV10 by Western blot. c). Restriction of MOV10 toward the replication of HBVin Huh7 by Northern blot. e). Restriction of MOV10 on two HBV promoter replication in Huh7 bySouthern blot. f). Toxicity of exogenous of MOV10 in Huh7 cell.注：*，P<0.05；**，P<0.01；NS：no significance為了進一步確認 MOV10 對 HBV 復(fù)制的抑制作用，我們在 HepG2.2.15 細胞中過表達 MOV10，提取病毒中間體，Southern blot 檢測 HBV DNA 水平，結(jié)果在
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R512.62

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本文編號：2628073