【摘要】：病毒感染會導致嚴重危害人類健康的疾病,常常引起全球的關注、擔憂甚至恐慌。例如美洲出現(xiàn)了寨卡病毒(ZIKV)的爆發(fā)流行,其感染導致小頭畸形癥和格林-巴利綜合征。登革熱病毒(DENV)每年大約造成3.9億人口感染,導致登革熱、登革出血熱以及登革休克綜合癥等。丙型肝炎病毒(HCV)感染導致慢性肝炎、肝硬化和肝癌,全球大約有1.7億人感染。病毒作為絕對的細胞內(nèi)寄生生物,必須進入宿主細胞才能啟動復制、傳播和維持病毒感染。因此干擾病毒進入宿主細胞途徑阻止病毒感染,是一種高效、優(yōu)良的抗病毒策略。為了進入宿主細胞,大多數(shù)病毒利用細胞的內(nèi)吞機器。病毒在細胞質(zhì)膜、內(nèi)吞體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜等位置通過膜融合或侵入將病毒核酸釋放到細胞內(nèi),該融合或侵入過程通常與pH值相關,而調(diào)節(jié)細胞和細胞器的pH值是離子通道的生理功能。顯然,離子通道在病毒進入宿主細胞過程應該扮演了十分重要的角色。但是宿主離子通道和病毒感染之間的關系很少被探究。離子通道是細胞質(zhì)膜或者細胞器膜內(nèi)外物質(zhì)進行離子交換的膜通道蛋白,對維持細胞的各種生理功能具有重要作用。Kv1.3鉀通道廣泛地分布在興奮與非興奮細胞的細胞質(zhì)膜和細胞器膜表面,介導細胞質(zhì)膜K+外流、細胞器膜K+內(nèi)流,對于維持靜息膜電位、調(diào)節(jié)膜的復極化、細胞增殖、細胞凋亡和細胞體積等至關重要。Kv1.3鉀通道異常表達與胰島素抗性、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性疾病、癌癥等密切相關,因此Kv1.3鉀通道被作為多種疾病治療與診斷的靶標。然而Kv1.3鉀通道和病毒感染之間的關系并不清楚。首先,本研究分析了馬氏正鉗蝎防御素BmKDfsin3的基因表達與功能。采用蝎子細菌感染模型、啟動子克隆與活性研究等,揭示了馬氏正鉗蝎防御素BmKDfsin3為組成型轉錄表達模式。在HCV Huh7.5.1細胞感染體系中,BmKDfsin3能夠濃度依賴地抑制HCV復制,其IC50為2.34 μM。與此同時,BmKDfsin3還具有Kv1.3鉀通道活性選擇性抑制功能,其IC50為23.4nM。過去我們課題組曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)Kv1.3鉀通道選擇性蝎毒素多肽抑制劑BmKTX-D33H和ADWX-1阻斷Kv1.3鉀通道活性的IC50分別為15.4pM和1.89pM,本研究發(fā)現(xiàn)它們也可以有效抑制HCV復制,其抑制HCV復制的IC50分別為1.22 μM和24.20 nM。研究暗示,Kv1.3鉀通道選擇性蝎毒素多肽抑制劑影響HCV復制可能具有普遍性,并且其抑制HCV復制功能與抑制Kv1.3通道活性功能呈正相關。這些實驗結果顯示,以馬氏正鉗蝎防御素BmKDfsin3為分子探針發(fā)現(xiàn)的Kv1.3鉀通道可能影響HCV復制。其次,研究了 Kv1.3鉀通道在HCV感染的人肝細胞系Huh7.5.1和肝組織中的表達與活性。RT-PCR、Western blot和免疫組化分析等揭示,在mRNA和蛋白質(zhì)水平上,人肝細胞系Huh7.5.1和肝臟組織均有Kv1.3鉀通道表達。采用全細胞膜片鉗技術,在Huh7.5.1細胞膜表面也能夠檢測到Kv1.3鉀通道電流。研究還發(fā)現(xiàn),HCV復制以不依賴于干擾素的方式上調(diào)Huh7.5.1細胞系中Kv1.3鉀通道的mRNA和蛋白含量,而且免疫組化分析顯示,HCV感染患者的肝組織中Kv1.3蛋白表達也升高了。同時,在構建的Kv1.3鉀通道穩(wěn)定過表達的Huh7.5.1細胞系Kv1.3-stable中,HCV復制不僅上調(diào)Kv1.3鉀通道的mRNA和蛋白含量,而且也增強其細胞膜表面Kv1.3鉀通道電流。這些實驗結果發(fā)現(xiàn)了 HCV復制能夠上調(diào)Kv1.3鉀通道的表達并增強宿主細胞膜Kv1.3鉀通道電流,暗示了宿主細胞Kv1.3鉀通道與HCV復制有十分緊密的聯(lián)系。然后,開展了 Kv1.3鉀通道對HCV復制影響的研究。采用分子克隆、細胞轉染、qRT-PCR和Western blot等技術在Huh7.5.1細胞中過表達Kv1.3鉀通道,實驗結果顯示,該通道的過表達會抑制HCV復制。同時,將過表達的Kv1.3鉀通道下調(diào)可以回復其對HCV復制的抑制作用。并且,Kv1.3鉀通道基因的敲除促進HCV復制。這些實驗結果顯示了宿主細胞Kv1.3鉀通道能夠有效地抑制HCV的復制。Kv1.3鉀通道抑制HCV復制的作用階段實驗表明:Kv1.3鉀通道抑制HCV進入宿主細胞過程,不影響HCV病毒顆粒的完整性和感染性,不作用于HCV進入宿主細胞的吸附階段,而作用于HCV進入細胞過程的吸附后階段。利用電子透射顯微鏡技術觀察到Kv1.3鉀通道能夠?qū)CV顆粒阻滯在囊泡中。因此,這些研究表明,宿主細胞Kv1.3鉀通道能夠抑制HCV進入宿主細胞,且密切相關于病毒包膜與內(nèi)吞體膜融合階段。接著,本研究闡明了 Kv1.3鉀通道抑制HCV進入宿主細胞的作用機制。在Huh7.5.1細胞中,Kv1.3鉀通道定位于早期內(nèi)吞體、晚期內(nèi)吞體、溶酶體等酸性細胞器上,且與HCV進入宿主細胞過程存在共定位。過表達Kv1.3鉀通道導致酸性細胞器pH升高。細胞與細胞膜融合研究發(fā)現(xiàn),Kv1.3鉀通道可以抑制HCV E1E2包膜蛋白介導的膜融合過程,而且過表達Kv1.3鉀通道可以放大酸性細胞器抑制細胞器膜融合。這些實驗結果表明,宿主細胞Kv1.3鉀通道通過抑制內(nèi)吞體酸化過程影響HCV包膜與內(nèi)吞體膜的融合,從而阻止HCV的RNA基因組釋放到細胞質(zhì),最終限制HCV進入宿主細胞。最后,研究了 Kv1.3鉀通道限制病毒進入宿主細胞的廣譜性。黃病毒科包膜病毒DENV和ZIKV具有與HCV類似的入胞過程,均經(jīng)由內(nèi)吞體酸化介導的膜融合過程進入宿主細胞。qRT-PCR、Western blot、噬斑實驗、透射電鏡和膜融合等實驗結果顯示,宿主細胞Kv1.3鉀通道同樣可以影響病毒包膜與宿主細胞內(nèi)吞體膜的融合,從而有效抑制DENV和ZIKV的復制。與HCV、DENV和ZIKV不同,副粘液病毒科的包膜病毒SeV進入細胞的膜融合過程是在中性pH條件和細胞質(zhì)膜表面發(fā)生。病毒RNA檢測實驗結果顯示,過表達Kv1.3鉀通道并不影響SeV復制。因此,Kv1.3鉀通道是一個廣譜的限制病毒進入宿主細胞的抗病毒蛋白,抑制經(jīng)由內(nèi)吞體酸化介導的膜融合過程進入宿主細胞的一類病毒的復制。綜上所述,本研究首先以馬氏正鉗蝎防御素BmKDfsin3為分子探針,發(fā)現(xiàn)了宿主細胞Kv1.3鉀通道影響HCV復制的可能。然后,揭示了宿主細胞Kv1.3鉀通道具有抑制HCV入胞過程膜融合作用的功能,闡明了宿主細胞Kv1.3鉀通道通過影響內(nèi)吞體酸化抑制膜融合過程的抗HCV感染機制,并證明了 Kv1.3鉀通道是一個廣譜的限制病毒進入宿主細胞的抗病毒蛋白。本研究首次發(fā)現(xiàn)了Kv1.3鉀通道抑制病毒進入宿主細胞過程膜融合階段的新功能,為防治HCV、DENV和ZIKV等黃病毒甚至其它病毒感染提供了新的策略與途徑,也為宿主細胞離子通道作為廣譜抗病毒靶標提供了理論基礎。
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基于非脊椎動物ＣＳａ（３防御素與ａ－ＫＴｘ具有相似的空間結構，孟蘭霞（２０１７）逡逑利用ＮＭＲ技術對與ａ－ＫＴｘ氨基酸性質(zhì)最為接近的ＢｍＫＤｆｓｉｎ３進行了結構解析逡逑（圖１．１），并研究了邋ＢｍＫＤｆｓｉｎ３，邋４和５對不同鉀通道活性的抑制功能。最終發(fā)逡逑現(xiàn)ＢｍＫＤｆｓｉｎ３能夠明顯抑制鉀通道Ｋｖｌ．ｌ、Ｋｖｌ．２、Ｋｖｌ．３和ＳＫ３通道活性，其逡逑中對Ｋｖｌ．３通道抑制活性最好，半數(shù)抑制濃度為２３．４邋士邋５．０邋ｎＭ；邋ＢｍＫＤｆｓｉｎ４對逡逑Ｋｖｌ．ｌ、Ｋｖｌ．２和Ｋｖｌ．３通道具有明顯抑制活性，對Ｋｖｌ．３通道抑制活性也最好，逡逑半數(shù)抑制濃度為５１０．２±邋１６１．２ｎＭ；邋ＢｍＫＤｆｓｉｎ５只能抑制ＳＫ３活性。通道突變體逡逑研究發(fā)現(xiàn)，ＢｍＫＤｆｓｉｎ３作用于Ｋｖｌ．３通道的孔區(qū)Ｓ５－Ｓ６邋ｌｉｎｋｅｒ。這是蝎防御素抑逡逑制離子通道活性功能的首次發(fā)現(xiàn)，并且發(fā)現(xiàn)了馬氏正鉗蝎防御素ＢｍＫＤｆｓｉｎ３作逡逑６逡逑

離子通道的開放和關閉稱為門控。門控性和離子選擇性是離子通道的兩大屬性。逡逑根據(jù)門控特性可將離子通道分為電壓門控離子通道、配體門控離子通道和其逡逑它類型離子通道。電壓門控離子通道的分類如圖１．２所示，，包括鉀通道、電壓門逡逑控鈉通道（ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ邋ｓｏｄｉｕｍ邋ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｎａｖ）、電壓門控鑰通道（ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ逡逑ｃａｌｃｉｕｍ邋ｃｈａｎｎｅｌｓ，ＶＧＣＣ邋或邋Ｃａｖ）、瞬時受體勢通道（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ逡逑ｃｈａｎｎｅｌｓ，邋ＴＲＰ）、ＣａｔＳｐｅｒ和雙孔通道（ＣａｔＳｐｅｒａｎｄＴＰＣｓ）、電壓門控質(zhì)子通道、逡逑阿諾定受體和環(huán)核苷酸調(diào)節(jié)通道（ｃｙｃｌｉｃｎｕｄｅｏｔｉｄｅ－ｍｏｄｕａｔｅｄｃｈａｎｎｅｌ，ＣＮＧ）等。逡逑其中鉀通道又分為電壓門控鉀通道（ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ邋ｐｏｔａｓｓｉｕｍ邋ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｋｖ）、雙孔逡逑鉀通道（ｔｗｏｐｏｒｅｐｏｔａｓｓｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｋ２ｐ）、內(nèi)向修復鉀通道（ｉｎｗａｒｄｌｙｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ逡逑ｐｏｔａｓｓｉｕｍ邋ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｋｉｒ）、媽和鈉激活的鉀通道。配體門控離子通道包括酸敏感逡逑（質(zhì)子門控）離子通道（ａｃｉｄ－ｓｅｎｓｉｎｇ邋（ｐｒｏｔｏｎ－ｇａｔｅｄ）邋ｉｏｎ邋ｃｈａｎｎｅｌｓ
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R511

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 張宗明,裘法祖;離子通道與疾病[J];世界華人消化雜志;2005年05期

2 王剛,祝延,孔德虎,陳生弟;離子通道病研究的現(xiàn)狀和展望[J];生理科學進展;2004年03期

本文編號：2626404