【摘要】：背景與目的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一個全球性的公共衛(wèi)生問題,其疾病譜多樣,可表現(xiàn)為無癥狀的攜帶者、肝炎活動、肝硬化或肝功能失代償。核苷(酸)類似物(nucleos(t)ide analogue,NA)治療能夠有效地抑制HBV DNA的復(fù)制水平,使肝功能復(fù)常,延緩肝硬化的進(jìn)展,降低肝臟失代償或肝細(xì)胞癌的發(fā)生,從而改善部分患者的預(yù)后。然而,NA治療對共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)卻無直接抑制作用,難以徹底根治HBV感染,其中斷治療以后極易發(fā)生病毒學(xué)復(fù)發(fā)和肝臟損傷,甚至誘發(fā)重癥肝炎導(dǎo)致患者的死亡。根據(jù)先前的臨床觀察,HBsAg攜帶者或已實(shí)現(xiàn)臨床治愈的HBsAg陰性患者,在接受激素、抗腫瘤藥物以及免疫抑制劑等之后,發(fā)生HBV再激活的風(fēng)險增加,表明了免疫因素即使在先前自發(fā)病毒控制的病人仍然在抑制病毒過程中發(fā)揮著極其重要的作用。目前尚不清楚慢性乙型肝炎中斷NA治療之后的病毒學(xué)復(fù)發(fā)是否與機(jī)體免疫狀態(tài)存在著聯(lián)系。自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞和病毒特異性T細(xì)胞是兩種最主要的效應(yīng)細(xì)胞,在清除HBV過程中扮演著非常重要的角色。然而,慢性HBV感染階段,特別在是高病毒血癥的患者,NK細(xì)胞和HBV特異性T細(xì)胞表現(xiàn)為功能失調(diào),抗病毒能力明顯減弱。本研究著重從免疫學(xué)的角度出發(fā),分析NK和病毒特異性T細(xì)胞反應(yīng)在中斷NA治療之后的縱向變化,并分析其與病毒學(xué)復(fù)發(fā)和肝臟損傷之間的相關(guān)性。為了進(jìn)一步闡明其在影響病毒學(xué)反應(yīng)中的作用,中斷NA治療時的細(xì)胞免疫也與自發(fā)性病毒控制的非活動性攜帶者和失敗的病毒控制的HBeAg陰性肝炎患者進(jìn)行橫斷面比較。方法1.研究設(shè)計:我們共隨訪24例經(jīng)NA治療HBeAg陰性的患者,在取得完全病毒學(xué)緩解(HBV DNA500 copies/mL)之后,鞏固治療時間至少超過兩年,中斷治療時血清HBsAg水平200 IU/mL,隨訪至少超過一年,根據(jù)一年以內(nèi)是否出現(xiàn)HBV DNA1×10~4 copies/mL,我們將其分為兩組:病毒學(xué)復(fù)發(fā)組(virologic relapse,VR)和非復(fù)發(fā)組(no virologic relapse,NVR);我們也隨訪了19例基線血清HBsAg水平200 IU/mL的非活動性攜帶者;此外,28例HBeAg陰性的慢性肝炎患者作為對照組。2.門診或住院部采集患者外周血樣,采用密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),并留取血漿,凍存。3.流式細(xì)胞術(shù)分別檢測NK細(xì)胞及其亞型的頻率、表型、分泌細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的能力和細(xì)胞毒活性。4.利用HBV核心抗原和S抗原的肽庫分別刺激PBMCs,體外培養(yǎng)10天后,流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+或CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的水平。5.體外IFN-γ的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(ELISpot)。結(jié)果研究隊列的臨床特點(diǎn)中斷NA治療后一年以內(nèi),14名患者發(fā)生病毒學(xué)復(fù)發(fā)(HBV DNA1×104copies/mL),其中9名患者發(fā)生臨床復(fù)發(fā)(同時滿足HBV DNA1×10~4 copies/mL和ALT80 U/L),一年以內(nèi)累積的病毒學(xué)復(fù)發(fā)和臨床復(fù)發(fā)率分別為58.3%和37.5%。作為對比,IC組在一年的隨訪中僅有2名患者出現(xiàn)血清HBV DNA水平1×104copies/mL,其中只有1名患者出現(xiàn)ALT異常(ALT80 U/L),均低于中斷NA治療組(P0.05)。血清HBsAg水平與ENEG組相比,VR組和NVR組中斷治療時,以及IC組血清HBsAg水平明顯較低(P0.01)。然而,VR組、NVR組和IC組之間的血清HBsAg水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。NVR組中斷治療后一年以內(nèi)血清HBsAg水平維持相對穩(wěn)定,而VR組病毒學(xué)反彈時的血清HBsAg水平明顯高于中斷NA治療時的血清HBsAg水平(P0.05)。NK細(xì)胞的頻率VR組和NVR組NK細(xì)胞及CD56~(bright)亞型的頻率無明顯差異(P0.05),且與ENEG組和IC組相比無明顯差異(P0.05)。與中斷NA治療時相比,無論是VR組還是NVR組,NK細(xì)胞及CD56bright亞型的頻率在一年的隨訪中均無明顯變化(P0.05)。NK細(xì)胞的表型VR組和ENEG組NK細(xì)胞表達(dá)抑制性受體CD96的水平明顯高于NVR組和IC組(P0.05)。VR組NK細(xì)胞表達(dá)的抑制性受體NKG2A水平明顯高于IC組(P0.05)。同樣,VR組在停藥后第1、6月NK細(xì)胞表達(dá)CD96的水平,和第3月NK細(xì)胞表達(dá)NKG2A的水平均顯著高于NVR組(P0.05)。此外,與VR、NVR、IC組相比,ENEG期CD69+NK細(xì)胞頻率明顯增加(P0.05)。縱向上來看,NVR組NK細(xì)胞表面受體的表達(dá)在一年的隨訪中相對穩(wěn)定。與此對比,VR組NK細(xì)胞表達(dá)活化性受體NKp44、NKG2C和CD69的水平在第6個月和第12個月時相較中斷治療時明顯增加。NK細(xì)胞功能與ENEG組相比,VR組的NK細(xì)胞在中斷NA治療時產(chǎn)生IFN-γ的能力部分恢復(fù),但是無論是IL-12/IL-18還是PMA/離子霉素刺激,均明顯弱于NVR組和IC組(P0.05)。與IC組相比,VR組在中斷NA治療時NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的能力相對減弱(P0.05)。NK細(xì)胞的殺傷活性是通過檢測穿孔素、顆粒酶B的表達(dá)以及CD107a的脫顆粒來決定,以上四組的細(xì)胞毒活性并無明顯差異。此外,VR組在中斷NA治療之后第1、3、6、12月NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力均明顯低于NVR組(P0.05)。在縱向分析中,NVR組在中斷NA治療后一年以內(nèi)NK細(xì)胞表達(dá)IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B和CD107a水平無明顯改變(P0.05)。相比之下,與中斷NA治療時相比,VR組停藥后第6、12月NK細(xì)胞表達(dá)穿孔素和CD107a的水平均明顯增加(P0.05)。NK細(xì)胞功能與肝臟損傷的相關(guān)性與中斷NA治療時和HBV DNA1×10~4 copies/mL時相比,VR組在HBV DNA1×10~4 copies/mL時NK細(xì)胞表達(dá)穿孔素和CD107a的水平明顯增加,而NK細(xì)胞表達(dá)IFN-γ的能力卻沒有相應(yīng)改善,表明了NK細(xì)胞功能向細(xì)胞毒活性發(fā)生偏移。此外,增加的穿孔素或CD107a陽性的NK細(xì)胞頻率與病毒學(xué)復(fù)發(fā)時的血清ALT水平呈正相關(guān)(P=0.003和P0.001)。病毒特異性T細(xì)胞反應(yīng)HBV核心抗原(core)肽庫刺激的T細(xì)胞反應(yīng),在中斷治療時及其后第3、6和12月CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ,在第6月時CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ,在第1、6月時CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的水平均明顯低于NVR組(P0.05)。與此同時,VR組和NVR組HBV S抗原肽庫刺激的T細(xì)胞反應(yīng)并無顯著性差異。橫斷面分析顯示,與ENEG組相比,NVR組core肽庫刺激的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ和IL-2的水平顯著提高(P0.05)。然而,與ENEG組相比,VR組core或S抗原肽庫刺激的T細(xì)胞反應(yīng)卻無明顯改善。與ENEG和VR組相比,IC組core抗原肽庫刺激的T細(xì)胞反應(yīng)均明顯增強(qiáng)(P0.05)。體外IFN-γELISpot分析顯示NVR組中斷治療后第3、6月時core肽庫刺激的SFC值明顯高于VR組(P0.05)。此外,在core肽庫刺激的反應(yīng)中,NVR組在中斷治療時SFC值高于ENEG組,VR組和ENEG組則明顯低于IC組(P0.05)。除NVR組停藥后第6月時產(chǎn)生IFN-γ的S抗原特異性CD8+T細(xì)胞外,與中斷治療時相比,我們未觀察到core或S特異性T細(xì)胞應(yīng)答的實(shí)質(zhì)性變化。結(jié)論低的NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力和core特異性T細(xì)胞反應(yīng)與中斷NA治療之后的病毒學(xué)復(fù)發(fā)有關(guān)。與非活動性攜帶者相比,經(jīng)NA治療的患者顯示出更受損的NK和病毒特異性T細(xì)胞反應(yīng),這與后者停藥后比較高的病毒學(xué)復(fù)發(fā)和臨床復(fù)發(fā)率相一致。NK細(xì)胞在病毒學(xué)復(fù)發(fā)時呈現(xiàn)為活化性的表型,功能向細(xì)胞毒活性發(fā)生偏移,且這種增加的細(xì)胞毒活性與中斷NA治療之后的肝臟損傷有關(guān)。本研究的科學(xué)價值我們的本研究有助于理解中斷NA治療之后病毒學(xué)復(fù)發(fā)和臨床復(fù)發(fā)背后的免疫學(xué)機(jī)制,并為安全停藥提供指導(dǎo)。針對NK細(xì)胞和HBV特異性T細(xì)胞的免疫治療可以逆轉(zhuǎn)病毒與宿主免疫之間的失衡,從而有助于實(shí)現(xiàn)更持久的病毒控制,甚至到達(dá)臨床治愈。此外,我們的研究也提供了一種有希望的策略:如果難以實(shí)現(xiàn)HBsAg血清學(xué)清除,在部分患者可通過治療實(shí)現(xiàn)有效的免疫重建,將其誘導(dǎo)成類似于非活動性攜帶者的狀態(tài),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)安全的斷藥。
【圖文】：
中斷治療時的血清 HBsAg 水平。HBsAg 單位為。中間的水平線為平均值。 *表示 P<0.05，**表示之后 HBV DNA、ALT 和 HBsAg 的變化療之后，NVR 組血清 HBV DNA、ALT 和 HBsAg 的R 組，，停藥后第 6、9、12 月較停藥時 HBVDNA、.05）。此外，較 NVR 組同一時間點(diǎn)，VR 組停藥后 ALT 的水平較高。
20 NA 治療之后血清 HBV DNA、ALT 和 HBsAg 的表 VR 組。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。*表示 P<0.0。毒學(xué)復(fù)發(fā)的相關(guān)性NA 是否＞1×104copies/mL，將 VR 組中斷 NA 治療分為兩組。與中斷 NA 治療時和 HBV DNA＜1×1DNA＞1×104copies/mL 時血清 HBsAg 水平明顯增
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R512.62
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本文編號：
2603460
