【摘要】：目的:通過構(gòu)建糖尿病兔、梅毒兔、糖尿病合并梅毒兔模型后,對比各實(shí)驗(yàn)組兔腎組織鈣化情況并通過基因芯片篩選腎組織中與之相關(guān)的差異表達(dá)基因,再檢測腎組織中鈣化相關(guān)差異基因的蛋白表達(dá)情況,初步探討糖尿病合并梅毒兔腎組織鈣化機(jī)制。方法:1.實(shí)驗(yàn)動物分組及建模:將新西蘭雄兔隨機(jī)分成四組并構(gòu)建正常組(C組)、糖尿病組(DM組)、梅毒組(TP組)和糖尿病合并梅毒組(H組)模型。2.HE染色:取各組兔腎組織石蠟切片脫蠟水化后用蘇木精浸染,鹽酸酒精分化,弱氨水返藍(lán)和乙醇及二甲苯脫水最后中性樹膠封片,觀察各組實(shí)驗(yàn)兔腎組織的鈣化情況。3.基因芯片檢測:取各實(shí)驗(yàn)組兔腎組織進(jìn)行基因芯片檢測,篩選出差異表達(dá)的鈣化相關(guān)基因。4.鈣化相關(guān)差異基因的PCR檢測:m RNA實(shí)時定量PCR檢測各組實(shí)驗(yàn)兔腎組織中鈣化相關(guān)基因表達(dá)的相對含量。5.鈣化相關(guān)差異基因蛋白表達(dá)的免疫印跡(Western blot,WB)檢測:提取腎臟組織蛋白測定濃度,配平后上樣跑膠,0.05A恒流轉(zhuǎn)膜45分鐘,再用牛奶封閉1小時,孵一抗4度過夜,將膜放入TBST溶液洗膜后放入溫箱孵二抗1小時,洗膜后顯影,檢測各組兔腎組織鈣化相關(guān)差異基因蛋白的表達(dá)情況。6.免疫組化檢測:取腎組織石蠟切片脫蠟水化,用3%過氧化氫(H2O2)去離子水孵育后用水沖洗PBS浸泡,通過5-10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉后再滴加一抗放入4度過夜之后用PBS沖洗,滴加二抗孵育后PBS沖洗,再滴加聚合物增強(qiáng)劑孵育后繼續(xù)用PBS沖洗,顯色后水洗然后復(fù)染、脫水、透明,最后封片。結(jié)果:1、糖尿病組(DM組)兔、梅毒組(TP組)兔和糖尿病合并梅毒組(H組)兔建模成功。2、HE染色結(jié)果顯示:正常組兔腎組織沒有明顯的異常改變,TP組、DM組和H組實(shí)驗(yàn)兔腎組織均可見腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張和近曲小管腫脹。并且DM組實(shí)驗(yàn)兔腎組織中集合管內(nèi)和腎髓質(zhì)區(qū)還可見蛋白管型、間質(zhì)粘液樣變、水泡樣變。H組實(shí)驗(yàn)兔中腎近曲小管腫脹和腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張更為嚴(yán)重,腎組織內(nèi)鈣鹽沉積明顯。3、基因芯片結(jié)果顯示:腎上腺素受體α1A(ADRA1A)、R型電壓依賴性鈣通道Ca V2.3(CACNA1E)、膽囊收縮素A受體(CCKAR)基因在各實(shí)驗(yàn)組兔腎組織中的差異顯著,與正常組相比,ADRA1A、CACNA1E、CCKAR基因含量在TP、DM、H組腎臟中上調(diào),在TP組少量上調(diào),DM組上調(diào)明顯,H組上調(diào)最高。4、ADRA1A、CACNA1E、CCKAR基因m RNA實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示:與C組相比,ADRA1A、CACNA1E基因在TP、DM、H組腎臟中的表達(dá)量均上調(diào),DM、H組的表達(dá)量比TP組高,H組中的表達(dá)量最高(其PCR表達(dá)量趨勢與基因芯片結(jié)果相符)。與C組相比,CCKAR基因在TP、DM、H組腎臟中的表達(dá)含量均上調(diào),DM、H組中的表達(dá)量比TP組高,但H組與DM組相比表達(dá)無差異。Toll樣受體4(TLR-4)和絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)基因m RNA實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示:與C組比較,其m RNA水平在TP、DM、H組腎臟中均有上調(diào),而H組上調(diào)最為明顯,與ADRA1A、CACNA1E的表達(dá)趨勢一致。5、WB檢測:ADRA1A、CACNA1E、CCKAR和TLR-4、MAPK1基因的蛋白表達(dá)水平與m RNA實(shí)時定量PCR結(jié)果相符,以H組的表達(dá)水平最高。6、免疫組化結(jié)果顯示:與C組正常兔相比,ADRA1A、CACNA1E、CCKAR、TLR-4和MAPK1基因在TP組、DM組、H組中的陽性細(xì)胞增多;H組中陽性細(xì)胞最多,其次為DM組;TP組則只有少量的表達(dá),C組陽性細(xì)胞表達(dá)量最少。結(jié)論:1.與糖尿病組和梅毒組相比,糖尿病合并梅毒組的炎癥反應(yīng)和腎臟鈣化更嚴(yán)重。2.與糖尿病組和梅毒組相比,糖尿病合并梅毒組的腎臟鈣化加重可能與ADRA1A和CACNA1E受體表達(dá)上調(diào)介導(dǎo)鈣內(nèi)流增加有關(guān);可能與CCKAR基因的表達(dá)上調(diào)無關(guān)。3.與糖尿病組和梅毒組相比,糖尿病合并梅毒組的腎臟鈣化加重可能與TLR-4受體和MAPK1基因表達(dá)上調(diào)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)增加有關(guān)。
【圖文】：

3.1 實(shí)驗(yàn)動物構(gòu)模成功我們課題組前期實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了糖尿病兔、梅毒兔和糖尿病合并梅毒兔[28]。3.2 HE 染色顯微鏡觀察各組實(shí)驗(yàn)兔腎組織發(fā)現(xiàn)，正常組兔腎組織沒有明顯的病理改變。與正常組相比，梅毒組兔腎組織的腎小球毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張和腎近曲小管輕度腫脹，腎髓質(zhì)區(qū)嗜酸粒細(xì)胞浸潤。糖尿病組兔腎組織內(nèi)除了有腎小球毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張和腎近曲小管輕度腫脹的病理改變外，髓質(zhì)區(qū)、集合管區(qū)可見蛋白管型、上皮管型和間質(zhì)粘液樣變（見圖 3.2.1）；糖尿病合并梅毒組兔腎組織除以上病理改變更加嚴(yán)重外，還有腎間質(zhì)局灶性淋巴細(xì)胞和少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、近曲小管上皮水樣變，，并且腎組織皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)的腎小管可見明顯的鈣鹽沉積（見圖圖 3.2.2）。第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

DM 組 H 組圖 3.2.2 各組實(shí)驗(yàn)兔腎組織 HE 染色結(jié)果圖（×400）3.3 基因芯片基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組兔腎臟中的 ADRA1A、CACNA1E 和 CCKAR基因差異顯著。糖尿病合并梅毒組（H 組）中 ADRA1A、CACNA1E 和 CCKAR基因的表達(dá)是正常組（C 組）的 3.6 倍，糖尿病合并梅毒組中 ADRA1A、CACNA1E和CCKAR基因的表達(dá)是梅毒組（TP組）的3.2倍，糖尿病組（DM組）中ADRA1A、CACNA1E 和 CCKAR 基因的表達(dá)是正常組的 1.4 倍。3.4 實(shí)時熒光定量 PCR（1）各實(shí)驗(yàn)分組兔腎臟中 ADRA1A 的 mRNA 表達(dá)量
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.1;R759.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2589395