【摘要】：目的:由人類免疫缺陷病毒(HIV-1)所引起的艾滋病是全世界最重要的公共衛(wèi)生問題之一。目前抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物是控制HIV-1的主要手段,但由于病毒潛伏庫的存在,該方法尚不能徹底治愈艾滋病。有研究顯示,HIV-1潛伏庫的存在與維持與HIV-1啟動子5’LTR的CpG島中的胞嘧啶甲基化有關(guān)。我們前期研究證實宿主限制性因子APOBEC3A(A3A)可催化HIV-1啟動子CpG島中的胞嘧啶去甲基化,促進(jìn)下游蛋白的表達(dá)。但A3A催化DNA去甲基化的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。A3A作為胞嘧啶脫氨酶,能夠識別甲基化胞嘧啶(mC),使其脫氨基形成胸腺嘧啶,導(dǎo)致T:G錯配。我們推測這一堿基錯配可激活下游的堿基切除修復(fù)(BER)途徑對其進(jìn)行切除、修復(fù),使mC再次轉(zhuǎn)化為胞嘧啶(C),從而完成mC的去甲基化。為證明這一假設(shè),本研究對BER途徑中起關(guān)鍵作用元件,包括DNA糖基化酶:甲基-CpG結(jié)構(gòu)域蛋白4(MBD4)和胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)、Gadd45a進(jìn)行如下分析,以期揭示A3A參與DNA主動去甲基化的分子機(jī)制。方法:1.構(gòu)建TDG、MBD4敲降及未敲降的293T細(xì)胞系(shTDG-293T、shMBD4-293T、shNC-293T)。然后,將pCAGGS-HA-A3A-a(A3A)或pCAGGSHA-A3G(A3G,對照)與甲基化pmeLTR-Luc2P-EGFP或未甲基化pLTR-Luc2PEGFP報告質(zhì)粒,分別共轉(zhuǎn)染shTDG-293T、shMBD4-293T和shNC-293T細(xì)胞,用雙熒光素酶實驗檢測TDG和MBD4的敲降對A3A去甲基化作用的影響。2.分別構(gòu)建表達(dá)TDG和MBD4的重組質(zhì)粒pCMV-Myc-TDG(TDG)和pCMVMyc-MBD4(MBD4),并分別將A3A與TDG或MBD4共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,用免疫共沉淀實驗檢測A3A與TDG,A3A與MBD4的結(jié)合情況,分析A3A與TDG和MBD4的相互作用。3.構(gòu)建表達(dá)Gadd45a的重組質(zhì)粒pCAAGGS-FlagGadd45a(Gadd45a),然后將Gadd45a、A3A和TDG,或Gadd45a、A3A和MBD4共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,用免疫共沉淀實驗檢測Gadd45a存在的情況下,A3A與TDG,A3A與MBD4的結(jié)合,探索Gadd45a蛋白在A3A與DNA糖基化酶相互作用中的作用。同時將也Gadd45a與TDG或MBD4共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,分析Gadd45a與DNA糖基化酶的相互作用。結(jié)果:1.TDG和MBD4敲降細(xì)胞在形態(tài)上與陰性對照細(xì)胞沒有差別。免疫印跡證實,TDG和MBD4敲降細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)蛋白的表達(dá)明顯降低。與shNC-293T細(xì)胞相比,共轉(zhuǎn)染A3A與pmeLTR-Luc2P-EGFP的shTDG-293T和shMBD4-293T細(xì)胞的熒光素酶的相對活性均下降,共轉(zhuǎn)染A3G與pmeLTR-Luc2P-EGFP的TDG和MBD4敲降細(xì)胞中的熒光素酶的相對活性沒有明顯變化。2.構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCMV-Myc-TDG和pCMV-Myc-MBD4分別經(jīng)EcoR I和Kpn I雙酶切之后,電泳獲得了與目的片段相同大小的電泳條帶,并且測序結(jié)果也與預(yù)期的一致。將A3A和TDG或MBD4共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,利用免疫共沉淀,在經(jīng)Myc抗體沉淀下來的Myc-TDG、Myc-MBD4相互作用蛋白復(fù)合物中檢測到A3A蛋白。3.構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCAAGGS-Flag-Gadd45a經(jīng)Kpn I和Xba I雙酶切鑒定,電泳顯示條帶與預(yù)期大小一致,并且測序結(jié)果也與預(yù)期一致。用抗Myc抗體對Gadd45a、A3A與TDG或MBD4共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫共沉淀,免疫印跡結(jié)果顯示在Gadd45a蛋白共轉(zhuǎn)染時,與Myc-TDG、Myc-MBD4相互作用的A3A蛋白增加。此外,Gadd45a還可以與TDG或MBD4蛋白共沉淀。結(jié)論:1.TDG和MBD4的敲降可以減弱A3A去甲基化作用,表明TDG和MBD4參與了A3A介導(dǎo)的HIV-1啟動子去甲基化。2.A3A與BER下游分子TDG和MBD4存在相互作用。3.Gadd45a分子可以增強A3A與TDG和MBD4的相互作用,并且Gadd45a也與TDG和MBD4有相互作用。表明A3A是通過BER途徑參與DNA主動去甲基化。
【圖文】：

基化胞嘧啶中的強共價鍵（碳-碳鍵）直接切割開的機(jī)制，主動 DNA 去甲基化主要是通過一系列修飾 5mC 的化學(xué)反應(yīng)發(fā)生的[26]。1.2.3.2 DNA 去甲基化機(jī)制DNA 甲基化機(jī)制中的 Dnmts 已被明確地定義，但關(guān)于 DNA 去甲基化的機(jī)制還有待探究。目前認(rèn)為，DNA 主動去甲基化過程涉及多種途徑（圖 1.1）。最受關(guān)注的由胞嘧啶脫氨酶（Cytidinedeaminase，CDA），包括活化誘導(dǎo)胞苷脫氨酶（Activation-induced cytidine dea minase，AID）和載脂蛋白 B mRNA 編輯酶（ApolipoproteinBmRNA-editingenzyme，APOBEC），直接介導(dǎo)的 DNA 去甲基化。另一途徑是由 10-11 易位（Ten-eleventranslocation，Tet）酶介導(dǎo)的。之后還提出 Tet 酶和 AID/APOBEC 共同介導(dǎo) DNA 的去甲基化機(jī)制[44]。其中，脫氨酶主要起催化胞嘧啶或其衍生物的脫氨基作用，引發(fā) DNA 主動去甲基化。Tet 酶的主要作用是逐步將 5mC 催化為 5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）及 5-羧基胞嘧啶（5caC）；此外，當(dāng) Tet 酶將 5mC 氧化為 5hmC 后，5hmC 也可以通過脫氨酶脫氨基以形成 5-羥甲基尿嘧啶（5hmU）。

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 APOBEC3A 調(diào)控 HIV-1 啟動子去甲基化的分子機(jī)制研究到 A3A 蛋白，證實 A3A 可分別與 TDG 和 MBD4 相互作用。此外，發(fā)現(xiàn) A3A-E72A 也可與 TDG 和 MBD4 相互作用，且與之結(jié)合能力與 A3A 相同（圖 3.6C），提示 E72 位點并不參與 A3A 與下游分子的結(jié)合。由此，我們可以認(rèn)為 TDG 和MBD4 均參與了 A3A 介導(dǎo)的 5mC 去甲基化。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R512.91

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本文編號：2588015