【摘要】：目前,慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B,CHB)的國(guó)際治療指南認(rèn)為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alamine transaminase,ALT)水平是反映肝臟組織學(xué)病變最重要的生化指標(biāo),通常情況下,ALT水平的升高是肝臟壞死性炎癥的標(biāo)志,也是抗病毒治療的指標(biāo),而ALT水平正常(PNALT)的CHB患者則不需要給予抗病毒治療,因?yàn)樗麄儧](méi)有或只有輕度肝臟壞死性炎癥的組織學(xué)改變。然而,最近的研究表明有28%-37%PNALT患者存在嚴(yán)重的肝臟損害程度,有些甚至是肝硬化或肝癌;另外,一些研究也表明血清ALT水平與一些CHB患者肝臟組織學(xué)病變程度的相關(guān)性較差,只依賴(lài)ALT水平對(duì)CHB患者治療具有較大的局限性。因此,尋找比ALT水平更靈敏、更特異的生物標(biāo)志物,是我們亟待解決的任務(wù)。微小RNA(MicroRNAs,MiRNAs)已成為近十年來(lái)分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),MiRNAs是一類(lèi)長(zhǎng)度約為19-22核苷酸非編碼的單鏈小分子RNA,廣泛存在于真核細(xì)胞中,成熟的MiRNAs通過(guò)與靶分子3'端非編碼區(qū)(3'-UTR)的序列互補(bǔ),在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá),參與了機(jī)體幾乎所有重要的生理過(guò)程。此外,由于特殊的結(jié)構(gòu)和存在方式,MiRNAs可以穩(wěn)定地存在于血漿或血清中,抵抗RNA酶的降解,因此,外周血MiRNAs可能成為許多疾病一種新的理想分子標(biāo)志物。最近大量研究也提供了明確的證據(jù),表明miRNAs大量存在于肝臟,調(diào)節(jié)肝臟的很多相關(guān)疾病。然而,目前miRNAs是否能作為PNALT發(fā)生肝損傷的分子診斷標(biāo)志物和參與調(diào)節(jié)機(jī)制的研究仍然不足。外泌體(exosomes)屬于一種微小囊泡,其大小約為30～120nm,通過(guò)微囊泡(microvesicles,MVs)內(nèi)陷生成,是多種細(xì)胞體內(nèi)分泌的小囊泡體,內(nèi)含生物活性蛋白,功能性RNA,miRNAs和其他非編碼小RNA。有研究指出,細(xì)胞受損后產(chǎn)生的miRNAs分子能夠轉(zhuǎn)移至血液循環(huán)中,可介導(dǎo)機(jī)體對(duì)細(xì)胞受損后的反應(yīng)過(guò)程。本研究旨在明確PNALT的CHB患者肝臟組織病理改變的發(fā)生率,并分析臨床生化指標(biāo)與這組人群肝損程度的相關(guān)性,探索是否可以找到預(yù)測(cè)PNALT患者顯著性壞死性炎癥和肝纖維化的臨床生化指標(biāo);然后用高通量miRNAs表達(dá)芯片篩選出能夠反應(yīng)PNALT患者肝臟損傷更加穩(wěn)定和靈敏的miRNAs分子標(biāo)志物,在分子層面進(jìn)一步完善指標(biāo)體系,為這部分患者得到及時(shí)診治提供全面的理論依據(jù);最后在人肝星狀細(xì)胞(human hepatitic stellate cells,HSCs)上清液中分離外泌體(exsome),檢測(cè)exsome中血漿差異表達(dá)的miRNAs含量,探索血漿差異表達(dá)的miRNAs在HSCs的存在方式,探討血漿差異表達(dá)miRNAs作為PNALT患者診斷肝臟損傷分子標(biāo)志物的可行性。第一部分丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶持續(xù)正常(PNALT)的慢性乙型肝炎(CHB)患者臨床病理學(xué)特征研究目的:明確PNALT患者中具有顯著性壞死性炎癥和肝纖維化的發(fā)生率;并分析臨床生化指標(biāo)與這組人群肝損程度的相關(guān)性,探索是否可以找到預(yù)測(cè)PNALT患者顯著性壞死性炎癥或肝纖維化的臨床生化指標(biāo)。方法:收集155例有肝穿刺活檢的PNALT患者,分別對(duì)肝臟的壞死性炎癥和纖維進(jìn)行Knodell炎癥活動(dòng)指數(shù)和Ishak纖維化程度評(píng)分;用logistics回歸分析臨床參數(shù)和壞死性炎癥及纖維化之間的關(guān)系以及采用接受者操作特征曲線(ROC)下面積(AUC)分析潛在預(yù)測(cè)因子的準(zhǔn)確性。結(jié)果:評(píng)分結(jié)果顯示PNALT患者中顯著性肝臟壞死性炎癥(Knodell炎癥活動(dòng)指數(shù)≥7)和肝纖維化(Ishak纖維化評(píng)分≥3)的分別占有36.5%和15.5%;根據(jù)單因素和多因素的 Logistic 回歸分析顯示:PLT(AUROC =0.905,cut-off值=171.5×109/ml)和GGT(AUROC =0.909,cut-off值=21.5U/1)水平可作為潛在中重度肝纖維化的獨(dú)立性預(yù)測(cè)因素。結(jié)論:分別36.5%和15.5%的PNALT患者肝臟有顯著性肝臟壞死性炎癥和肝纖維化的組織學(xué)改變;可以通過(guò)PLT和GGT的水平預(yù)測(cè)PNALT患者肝臟纖維化的程度。第二部分丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶正常(PNALT)的慢性乙型肝炎(CHB)患者miRNAs標(biāo)志物篩選的研究目的:miRNAs在血漿中異常表達(dá)的水平能夠反映疾病的病理進(jìn)程,因此可以成為許多疾病的診斷和預(yù)后的理想生物標(biāo)志物;本研究旨在為肝臟組織學(xué)顯示有顯著性壞死性炎癥和纖維化改變的PNALT患者篩選出穩(wěn)定和敏感的miRNAs生物標(biāo)志物。方法:采用miRNAs芯片技術(shù)在NPNALT(正常的ALT水平且沒(méi)有顯著性肝臟損傷患者)、SPNALT(正常的ALT水平但有顯著性肝臟損傷患者)和Healthy(健康人群)三個(gè)獨(dú)立樣本組中進(jìn)行miRNAs篩選;應(yīng)用Taqman探針定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈(qRT-PCR)方法在每組獨(dú)立樣本中和擴(kuò)大樣本中驗(yàn)證篩選得到差異表達(dá)的miRNAs,采用接收操作特性曲線(ROC)和曲線下面積(AUC)來(lái)分析最終驗(yàn)證得到SPNALT差異表達(dá)的miRNAs作為診斷指標(biāo)的準(zhǔn)確性。結(jié)果:經(jīng)miRNAs芯片篩選得到18種差異表達(dá)的miRNAs(fold change2.0或0.5,P0.05),Taqman 探針 qRT-PCR 方法驗(yàn)證最終得出 miR-122-5p 和 miR-151-3p可以作為SPNALT患者的診斷指標(biāo),AUC分析結(jié)果顯示miR-122-5p和miR-151-3 p分別為0.901(95%可信區(qū)間,0.825-0.982;敏感性=80%,特異性=87%)和0.844(95%可信區(qū)間,0.745-0.943;敏感性=76.7%,特異性=87.3%)。結(jié)論:MiR-122-5P and miR-151-3P可能成為SPNALT穩(wěn)定和敏感的分子生物診斷標(biāo)志物,對(duì)PNALT的CHB患者早期診斷和治療具有一定的價(jià)值。第三部分檢測(cè)人肝星狀細(xì)胞上清中血漿差異miRNAs的存在形式目的:觀察第二部分SPNALT差異表達(dá)的miRNAs在人肝星狀細(xì)胞上清中的存在形式,進(jìn)而探討血漿差異表達(dá)的miRNAs作為SPNALT分子診斷標(biāo)志物的可行性。方法:低速旋轉(zhuǎn)和高速離心法提取人肝星狀細(xì)胞(HSC-LX2)的上清液,用Taqman qRT-PCR方法檢測(cè)離心后外泌體(exosomes)沉淀,未離心的上清和離心后上清三組中SPNALT差異表達(dá)的miRNAs含量,運(yùn)用方差分析和SNK方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:miR-122-5p,miR-140-3p,miR-151a-3p 和miR-320d 4 種 miRNAs 在 HSC 細(xì)胞上清中均檢出,且在exosomes中含量較高,ACt值分別為5.23±0.8,4.28±1.11,6.62±0.78和5.17±0.87,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:miR-122-5p,miR-140-3p,miR-151a-3p 和 miR-320d 均以 exosomes 的形式存在于HSC-LX2上清中,提示miR-122-5p和miR-151a-3p作為SPNALT的分子診斷標(biāo)志物具有可行性。
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裕┑惱閑砸倚透窩祝ǎ茫齲攏┗頰叩牟±硌мo團(tuán)z逡逑圖２Ａ：經(jīng)典的壞死性炎癥病理組織學(xué)特征－肝臟匯管區(qū)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)伴界逡逑板性炎ＨＥ染倉(cāng)（１０ｘ１０）逡逑ｔＰ餐余，

本文編號(hào)：2579607