【摘要】：結(jié)核病是世界性的社會經(jīng)濟(jì)問題,尤其是在發(fā)展中國家,嚴(yán)重威脅人類的生命健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)報(bào)道,目前全世界超過三分之一的人口已感染結(jié)核菌,每年有近900萬新發(fā)病例,300萬人死于結(jié)核病。疫苗是預(yù)防和控制結(jié)核病的最佳途徑,但目前國內(nèi)外臨床應(yīng)用的只有卡介苗一種,且其預(yù)防效果存在較大爭議,急需研制新型有效的結(jié)核疫苗。早期、快速、準(zhǔn)確診斷對于結(jié)核病的防治至關(guān)重要,臨床上尚缺乏特異、敏感的診斷方法,血清免疫學(xué)檢查比其他實(shí)驗(yàn)室方法具有固有優(yōu)勢�；诮Y(jié)核分枝桿菌特異性抗原的融合蛋白是目前研究與開發(fā)結(jié)核疫苗、診斷方法及制劑的主要方向之一。國內(nèi)外最新研究表明,Ag85B、ESAT-6抗原蛋白可作為研發(fā)結(jié)核疫苗、診斷制劑的理想靶抗原。WbbL為結(jié)核分枝桿菌特有的胞外功能蛋白,序列結(jié)構(gòu)保守,種屬特異性高,存在潛在抗原表位,很可能作為分枝桿菌感染的特異性分子標(biāo)志。轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗、診斷制劑為醫(yī)用結(jié)核疫苗、診斷新方法的研發(fā)提供了新途徑。 本研究首先克隆結(jié)核分枝桿菌rfbpB、esxA和rwbbLJ基因,獲得rfbpB-esxA、 rfbpB-esxA-rwbbL1融合抗原編碼基因；通過原核表達(dá)載體pET-30a,馬鈴薯X病毒載體pgR107、植物二元載體pBI121介導(dǎo)其在大腸桿菌及煙草葉片中進(jìn)行表達(dá),獲得特異的抗原蛋白；體內(nèi)、體外觀察評價(jià)所得到的純化蛋白的免疫原性及保護(hù)效果,闡明各種抗原物質(zhì)的臨床診斷價(jià)值、疫苗應(yīng)用前景及免疫應(yīng)答機(jī)制。主要研究結(jié)果如下： 1)對結(jié)核分枝桿菌wbbLl基因及rfbpB-esxA融合基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,wbbLl基因編碼鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶(Rhamnosyl Transferase, WbbL);該蛋白位于細(xì)胞外,二級結(jié)構(gòu)以α螺旋為主,含有一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域,存在6個(gè)潛在抗原表位且有很好的抗原物質(zhì)潛力；蛋白序列、結(jié)構(gòu)保守,為結(jié)核分枝桿菌所特有。WbbL蛋白很可能是理想的結(jié)核免疫診斷方法、疫苗及抗結(jié)核藥物的靶分子。疏水性接頭(Gly4Ser)3的引入不會改變Ag85B、ESAT-6蛋白的抗原性。 2)應(yīng)用PCR、SOE-PCR技術(shù)克隆獲得了rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA及rfbpB-esxA-rwbbLl融合基因,通過基因工程技術(shù),構(gòu)建了攜帶各單基因及融合基因的原核表達(dá)載體,PCR、酶切鑒定及測序表明構(gòu)建成功。IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)蛋白表達(dá),SDS-PAGE分析表明在大腸桿菌中表達(dá)出了Ag85B、ESAT-6、WbbL Ag85B-ESAT-6及Ag85B-ESAT-6-WbbL蛋白,但大部分以包涵體的形式存在。通過誘導(dǎo)條件的優(yōu)化,獲得了可溶蛋白組分,其中ESAT-6、WbbL及Ag85B-ESAT-6-WbbL蛋白的優(yōu)化效果較好。采用親和層析方法獲得了純化蛋白,Western blotting鑒定表明各種表達(dá)蛋白與His-tag形成了融合蛋白,表達(dá)正確。 3)應(yīng)用PCR技術(shù)對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,獲得了適合植物表達(dá)的各單基因及融合基因,然后將其構(gòu)建于PVX載體pgR107及植物二元載體pBI121上, PCR、酶切鑒定及測序表明構(gòu)建成功。通過植物轉(zhuǎn)基因技術(shù),葉片注射法侵染煙草,在侵染液OD600介于0.8-1.0之間時(shí),侵染效果最佳。通過pgR107-GFP所攜帶的綠色熒光蛋白及pBL121所攜帶的GUS檢測確定了外源蛋白的最高表達(dá)時(shí)間階段,其中PVX載體在第7天時(shí)表達(dá)量最高,pBI121系列載體為侵染后的第2天。提取葉片總蛋白SDS-PAGE分析表明Ag85B、ESAT-6、WbbL及Ag85B-ESAT-6蛋白在煙草中獲得了表達(dá),獲得了純化蛋白。Western blotting鑒定表明蛋白表達(dá)正確。 4)以大腸桿菌、煙草中表達(dá)的各種純化蛋白為抗原,建立以結(jié)核患者血清為一抗的ELISA檢測方法,評價(jià)觀察表明各種蛋白診斷特異性較好(均超過90%),敏感性差別較大,融合蛋白好于單一抗原蛋白,從高到低依次為Ag85B-ESAT-6-WbbL、Ag85B-ESAT-6、ESAT-6、Ag85B及WbbL。由于WbbL蛋白在結(jié)核感染全程表達(dá),可能更適合應(yīng)用于其中、后期的診斷。初次免疫-加強(qiáng)免疫策略免疫小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各蛋白均有良好的免疫原性,可激發(fā)產(chǎn)生以Thl型為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答,原核表達(dá)及植物表達(dá)的蛋白免疫效果幾乎一致。與NS對照組相比,激發(fā)小鼠產(chǎn)生的血清特異IgG、IFN-γ及IL-2水平顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 本研究將為研制和開發(fā)新型的人畜共用結(jié)核疫苗、臨床診斷試劑提供了新思路、新材料并奠定了一定的理論基礎(chǔ),對防治結(jié)核病具有較大的臨床意義。
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R52

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2563620