【摘要】：結核病是世界性的社會經(jīng)濟問題,尤其是在發(fā)展中國家,嚴重威脅人類的生命健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)報道,目前全世界超過三分之一的人口已感染結核菌,每年有近900萬新發(fā)病例,300萬人死于結核病。疫苗是預防和控制結核病的最佳途徑,但目前國內(nèi)外臨床應用的只有卡介苗一種,且其預防效果存在較大爭議,急需研制新型有效的結核疫苗。早期、快速、準確診斷對于結核病的防治至關重要,臨床上尚缺乏特異、敏感的診斷方法,血清免疫學檢查比其他實驗室方法具有固有優(yōu)勢�；诮Y核分枝桿菌特異性抗原的融合蛋白是目前研究與開發(fā)結核疫苗、診斷方法及制劑的主要方向之一。國內(nèi)外最新研究表明,Ag85B、ESAT-6抗原蛋白可作為研發(fā)結核疫苗、診斷制劑的理想靶抗原。WbbL為結核分枝桿菌特有的胞外功能蛋白,序列結構保守,種屬特異性高,存在潛在抗原表位,很可能作為分枝桿菌感染的特異性分子標志。轉基因植物作為生物反應器生產(chǎn)口服疫苗、診斷制劑為醫(yī)用結核疫苗、診斷新方法的研發(fā)提供了新途徑。 本研究首先克隆結核分枝桿菌rfbpB、esxA和rwbbLJ基因,獲得rfbpB-esxA、 rfbpB-esxA-rwbbL1融合抗原編碼基因；通過原核表達載體pET-30a,馬鈴薯X病毒載體pgR107、植物二元載體pBI121介導其在大腸桿菌及煙草葉片中進行表達,獲得特異的抗原蛋白；體內(nèi)、體外觀察評價所得到的純化蛋白的免疫原性及保護效果,闡明各種抗原物質的臨床診斷價值、疫苗應用前景及免疫應答機制。主要研究結果如下： 1)對結核分枝桿菌wbbLl基因及rfbpB-esxA融合基因的生物信息學分析結果表明,wbbLl基因編碼鼠李糖基轉移酶(Rhamnosyl Transferase, WbbL);該蛋白位于細胞外,二級結構以α螺旋為主,含有一個糖基轉移酶的結構域,存在6個潛在抗原表位且有很好的抗原物質潛力；蛋白序列、結構保守,為結核分枝桿菌所特有。WbbL蛋白很可能是理想的結核免疫診斷方法、疫苗及抗結核藥物的靶分子。疏水性接頭(Gly4Ser)3的引入不會改變Ag85B、ESAT-6蛋白的抗原性。 2)應用PCR、SOE-PCR技術克隆獲得了rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA及rfbpB-esxA-rwbbLl融合基因,通過基因工程技術,構建了攜帶各單基因及融合基因的原核表達載體,PCR、酶切鑒定及測序表明構建成功。IPTG作為誘導劑誘導蛋白表達,SDS-PAGE分析表明在大腸桿菌中表達出了Ag85B、ESAT-6、WbbL Ag85B-ESAT-6及Ag85B-ESAT-6-WbbL蛋白,但大部分以包涵體的形式存在。通過誘導條件的優(yōu)化,獲得了可溶蛋白組分,其中ESAT-6、WbbL及Ag85B-ESAT-6-WbbL蛋白的優(yōu)化效果較好。采用親和層析方法獲得了純化蛋白,Western blotting鑒定表明各種表達蛋白與His-tag形成了融合蛋白,表達正確。 3)應用PCR技術對基因結構進行改造,獲得了適合植物表達的各單基因及融合基因,然后將其構建于PVX載體pgR107及植物二元載體pBI121上, PCR、酶切鑒定及測序表明構建成功。通過植物轉基因技術,葉片注射法侵染煙草,在侵染液OD600介于0.8-1.0之間時,侵染效果最佳。通過pgR107-GFP所攜帶的綠色熒光蛋白及pBL121所攜帶的GUS檢測確定了外源蛋白的最高表達時間階段,其中PVX載體在第7天時表達量最高,pBI121系列載體為侵染后的第2天。提取葉片總蛋白SDS-PAGE分析表明Ag85B、ESAT-6、WbbL及Ag85B-ESAT-6蛋白在煙草中獲得了表達,獲得了純化蛋白。Western blotting鑒定表明蛋白表達正確。 4)以大腸桿菌、煙草中表達的各種純化蛋白為抗原,建立以結核患者血清為一抗的ELISA檢測方法,評價觀察表明各種蛋白診斷特異性較好(均超過90%),敏感性差別較大,融合蛋白好于單一抗原蛋白,從高到低依次為Ag85B-ESAT-6-WbbL、Ag85B-ESAT-6、ESAT-6、Ag85B及WbbL。由于WbbL蛋白在結核感染全程表達,可能更適合應用于其中、后期的診斷。初次免疫-加強免疫策略免疫小鼠動物實驗結果表明,各蛋白均有良好的免疫原性,可激發(fā)產(chǎn)生以Thl型為主的細胞免疫應答,原核表達及植物表達的蛋白免疫效果幾乎一致。與NS對照組相比,激發(fā)小鼠產(chǎn)生的血清特異IgG、IFN-γ及IL-2水平顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 本研究將為研制和開發(fā)新型的人畜共用結核疫苗、臨床診斷試劑提供了新思路、新材料并奠定了一定的理論基礎,對防治結核病具有較大的臨床意義。
【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R52

【參考文獻】

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本文編號：2563620