【摘要】：20世紀(jì)70年代末，福氏志賀菌F4c亞型首次被前蘇聯(lián)科學(xué)家分離，并提示其可能成為優(yōu)勢(shì)流行菌株。自2003年10月起，我國(guó)多個(gè)省市均發(fā)現(xiàn)該菌的爆發(fā)或散發(fā)流行，且在部分省市呈逐年上升的趨勢(shì)，已成為部分地區(qū)細(xì)菌性痢疾流行的優(yōu)勢(shì)菌型。由于目前各地僅對(duì)局部的福氏志賀菌F4c亞型進(jìn)行了分離鑒定，福氏志賀菌F4c亞型的整體情況及特征卻知之甚少。為全面了解其福氏志賀菌F4c亞型的生物學(xué)特性、流行特征和變異規(guī)律，本研究對(duì)2003年至2013年期間收集的來(lái)源于7個(gè)省市的F4c菌株進(jìn)行了生化特征、血清學(xué)特征、毒力基因及耐藥譜進(jìn)行生物學(xué)特征分析，對(duì)其脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulsed—field gel electrophoresis，PFGE）、多位點(diǎn)序列分型（Multilocus Sequenee Typing， MLST）、質(zhì)粒圖譜進(jìn)行分析，了解其分子分型特點(diǎn)，并對(duì)F4c亞型進(jìn)行了全基因組測(cè)序，以期通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法深入了解我國(guó)福氏志賀菌F4c亞型的生物學(xué)特性、流行特征和變異規(guī)律，對(duì)于進(jìn)一步研究細(xì)菌性痢疾的傳播流行規(guī)律及防控策略的制定和調(diào)整均有重要的科學(xué)意義。 本研究收集了2003年至2013年期間，包括北京、新疆、上海、甘肅、沈陽(yáng)、廣西和河南等7個(gè)省及直轄市共30多家哨點(diǎn)醫(yī)院分離的204株福氏志賀菌F4c亞型。通過(guò)血清學(xué)鑒定、生化鑒定、藥物敏感實(shí)驗(yàn)和毒力基因檢測(cè)，從204株F4c亞型中挑選出流行病學(xué)和遺傳背景無(wú)關(guān)的11株代表性菌株進(jìn)行血清O抗原基因的鑒定，以全面了解其生物學(xué)特性。對(duì)204株福氏志賀菌F4c亞型進(jìn)行PFGE分子分型；并從中選取不同地區(qū)、不同年份且毒力基因型別差異較大的60株進(jìn)行質(zhì)粒圖譜分析、37株進(jìn)行MLST分子分型，選擇北京地區(qū)分離的1株福氏志賀菌F4c亞型進(jìn)行全基因組測(cè)序。 日本Denka Seiken血清凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：204株福氏F4c型菌株與福氏多價(jià)血清發(fā)生強(qiáng)凝集反應(yīng)、與福氏Ⅳ型多價(jià)發(fā)生強(qiáng)凝集反應(yīng)、與群因子血清7（8）發(fā)生凝集反應(yīng)；但不與群因子血清（3）4、6發(fā)生血清凝集反應(yīng)。血清抗原結(jié)構(gòu)式為（Ⅳ：7，8），與文獻(xiàn)報(bào)告的F4c血清分型結(jié)果均相同。使用瑞典單克隆抗體血清（MASF）進(jìn)一步細(xì)化血清學(xué)分型鑒定，結(jié)果顯示204株福氏F4c型菌株與血清群福氏多價(jià)B抗體呈凝集反應(yīng)，與群因子血清7，8呈凝集反應(yīng)，與群因子血清Ⅳ-1呈凝集反應(yīng)，與其他各個(gè)型因子血清均不凝集，MASF血清鑒定結(jié)果MASF：B+，IV：I+，7（8）+；與FXv的MASF血清鑒定結(jié)果相同。另外，挑選11株代表性菌株鑒定其福氏4型和福氏X型部分血清O抗原特異性基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究的福氏志賀菌F4c亞型100%攜帶福氏志賀菌wzx1-5型O抗原合成基因；100%攜帶O抗原修飾基因gtrX（葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因）；100%不攜帶O抗原修飾基因gtrⅣ基因（葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因）和oac基因（O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因），F(xiàn)4c所攜帶的部分血清O抗原特異性基因與FXv相同。 204株福氏志賀菌F4c亞型的API-20E生化反應(yīng)鑒定結(jié)果：以發(fā)酵葡萄糖、分解甘露醇為主，有四種生化反應(yīng)結(jié)果存在差異，主要包括吲哚實(shí)驗(yàn)，明膠液化實(shí)驗(yàn)，蜜二糖實(shí)驗(yàn)和阿拉伯糖實(shí)驗(yàn)。204株福氏志賀菌F4c亞型中，吲哚實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性菌株共有28株（占13.73%）；明膠液化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性菌株共有2株（占0.98%）；蜜二糖實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性菌株共有26株（占12.75%）；阿拉伯糖實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性菌株共有201株（占98.53%）。在204株福氏志賀菌F4c亞型中，吲哚實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性菌株比例較高的地區(qū)是河南和沈陽(yáng)，吲哚實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性菌株最多的年份為2007年。蜜二糖實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性菌株最多的地區(qū)為甘肅、河南和新疆，蜜二糖實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性株最多的年份為2003年、2011年和2006年。明膠液化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性株均分離自廣西，具體年份不詳。阿拉伯糖陰性共有3株，分別為2004年新疆株、北京株和2007年上海株。其中，2株明膠液化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性菌株為首次在福氏志賀菌F4c亞型中發(fā)現(xiàn)。 2009年之后，國(guó)內(nèi)報(bào)道的福氏志賀菌F4c亞型菌株對(duì)慶大霉素、妥布霉素和二、三代頭孢類抗生素抗生素的敏感率都呈明顯下降趨勢(shì)。本次對(duì)青霉素類抗生素氨芐西林敏感率僅為3.92%、哌拉西林的敏感率為75.49%；對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物類藥物氨芐西林/舒巴坦的敏感率僅為4.41%、而哌拉西林/他唑巴坦的敏感率卻達(dá)100%；頭孢類抗生素敏感實(shí)驗(yàn)的敏感率從76.96%～99.51%不等；三種氨基糖苷抗生素的敏感率達(dá)到84.8%以上；2種氟喹諾酮類抗生素的藥物敏感率分別為86.27%和88.24%；磺胺類（葉酸代謝途徑抑制劑）抗生素復(fù)方新諾明敏感率為29.41%；對(duì)呋喃妥因、氨曲南、亞胺培南敏感率96.08%。204株福氏志賀菌F4c亞型只有4株對(duì)20種抗生素全部敏感。另外，上海、甘肅、河南的多重耐藥率為100%，耐藥達(dá)到3種以上抗生素的菌株占全部菌株數(shù)量的77.45%。北京和上海兩地出現(xiàn)耐10種以上抗生素的菌株，北京耐10種以上抗生素菌株的比例為3.84%，而上海的比例為17.89%。 為了解福氏志賀菌F4c亞型的毒力基因攜帶情況，選取與福氏志賀菌相關(guān)的12對(duì)毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，攜帶全部12對(duì)毒力基因的菌株達(dá)158株（77.45%），ipaH1.4和shiD-Full基因在204株菌中的攜帶率為100%，ial基因的攜帶率最低，為86.27%。上海和廣西地區(qū)菌株的ial基因、ipaH基因的攜帶率低于其他地區(qū)的菌株。204株福氏志賀菌F4c亞型可按毒力基因的攜帶情況分為21個(gè)毒力基因型，其中1型占77.45%，是6個(gè)地區(qū)的優(yōu)勢(shì)毒力基因模式（廣西除外，廣西為4型和14）。結(jié)合生化結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)吲哚實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性或蜜二糖發(fā)酵陽(yáng)性抑或阿拉伯糖發(fā)酵陰性時(shí)，福氏志賀菌F4c亞型的毒力基因攜帶率高，毒性比較強(qiáng)，且具有這種生化反應(yīng)結(jié)果的菌株容易引起疫情暴發(fā)。另外，北京和上海兩個(gè)地區(qū)的菌株毒力基因的攜帶情況分析顯示：缺失ipaH9.8基因的福氏志賀菌F4c亞型頭孢類抗生素敏感率降低。 本研究選擇了60株毒力基因和抗生素敏感性差異比較明顯的F4c菌株進(jìn)行質(zhì)粒圖譜分析：該菌攜帶的質(zhì)粒呈現(xiàn)多樣化，60株菌中21株攜帶220kb左右的大質(zhì)粒，23株攜帶140kb左右的大質(zhì)粒；60株菌中60株攜帶4.1kb的小質(zhì)粒，56株菌攜帶2.2kb的小質(zhì)粒，55株菌攜帶1.8kb的小質(zhì)粒；不帶有10.5kb和4.8kb的小質(zhì)粒；出現(xiàn)了1.0kb的小質(zhì)粒。60株存在4.1kb小質(zhì)粒的菌株均帶有毒力基因shiD-Full和ipaH1.4；7株缺失毒力基因ial、ipaH7.8和ipaH4.5的菌株具有3～5個(gè)不同的小質(zhì)粒；27株ial基因陰性的菌株中，25株不具有大小在220kb的毒力大質(zhì)粒。 本研究使用NotI限制性內(nèi)切酶對(duì)204株福氏志賀菌F4c亞型進(jìn)行PFGE分子分型分析。酶切片段在20kb至135kb之間，每株菌可得到大約14條左右的PFGE條帶。204株福氏志賀菌F4c亞型Dice系數(shù)在80%～100%之間，共生成81個(gè)帶型，優(yōu)勢(shì)帶型為FN11.004（31株，占15.20%）；可分為28個(gè)聚類型：聚類1型（FN11.001-FN11.023）共108株，占52.94%；聚類2型（FN11.024-FN11.029）共17株，，占8.33%；聚類4型（FN11.032-FN11.036）共8株，占3.92%；聚類10型（FN11.046-FN11.050）共7株，占3.43%；聚類18型（FN11.064-FN11.067）共9株，占4.41%；其余各聚類菌株數(shù)量均在5株以下。聚類分析發(fā)現(xiàn)2009年之前的菌株遺傳相似程度比較高，除河南以外（不排除河南菌株較少的原因），各地區(qū)菌株Dice系數(shù)均在80%~92%之間。北京地區(qū)、新疆地區(qū)和沈陽(yáng)三地的F4c菌株優(yōu)勢(shì)帶型均為FN11.004；11株廣西地區(qū)F4c亞型分為11個(gè)帶型和7個(gè)聚類型。 多位點(diǎn)序列分析（MLST）分析發(fā)現(xiàn)：所有的F4c亞型菌株之間的等位基因值相同，均屬于相同的序列型ST245。從系統(tǒng)進(jìn)化圖分析，ST245與ST651、ST633、ST627、ST255和ST240等屬于ST245Cplx，只有1個(gè)位點(diǎn)的變異，遺傳距離較近，可以說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系也較近。ST629、ST631、ST264和ST248、ST630也屬于ST245Cplx，有2-3個(gè)位點(diǎn)的變異，ST245Cplx極有可能由ST270的EIEC進(jìn)化而來(lái)。 全基因組測(cè)序后的結(jié)果分析顯示，福氏志賀菌F4c亞型與參考菌株福氏志賀菌FXv亞型O抗原序列相似度較高，但F4c還有來(lái)源于F2a和大腸等及其他菌型的基因和質(zhì)粒，這些差別到底會(huì)對(duì)福氏志賀菌F4c亞型的致病性和表型產(chǎn)生多大影響尚未得知，但目前分析的結(jié)果至少提示F4c與FXv為同一血清型，可能屬于同一血清型的不同基因型。 本次分析的福氏志賀菌F4c亞型O抗原特異性基因gtrX陽(yáng)性，與Fx及Fxv相同，而血清凝集實(shí)驗(yàn)為福氏4型，與FX及FXv均不相同，可能命名為F4型或F4v型比較合適。本次研究的福氏志賀菌F4c亞型菌株發(fā)酵葡萄糖，甘露醇實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，并首次檢出來(lái)源于廣西的明膠液化陽(yáng)性菌株。我國(guó)福氏志賀菌F4c亞型對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦普遍耐藥，對(duì)哌拉西林、復(fù)方新諾明、慶大霉素、妥布霉素和二、三代頭孢類抗生素的耐藥率也呈逐年上升的趨勢(shì)，對(duì)喹諾酮類抗生素敏感。北京地區(qū)我國(guó)福氏志賀菌F4c亞型耐藥率低，毒力基因攜帶率高；而上海地區(qū)則耐藥率高，毒力基因攜帶率低。上海及廣西毒力基因攜帶率低于其他地區(qū)。福氏志賀菌F4c亞型主要攜帶220kb和140kb二種大質(zhì)粒；4.1kb，2.2kb和1.8kb三種小質(zhì)粒。204株菌分為81個(gè)型，優(yōu)勢(shì)帶型為FN11.004型。新疆，北京，沈陽(yáng)優(yōu)勢(shì)帶型相同。MLST分型為ST245型。福氏志賀菌F4c亞型與參考菌株福氏志賀菌FXv亞型O抗原序列基本一致，二者為相同血清型。
【圖文】：

事醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 我國(guó)福氏志賀菌 F4c 亞型的表型及生物學(xué)因此，本研究 204 株福氏志賀菌 F4c 亞型的日本生研血清和 MASF 血集反應(yīng)結(jié)果，與孫強(qiáng)正等[34]研究的 FXv 的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果沒(méi)。2 血清 O 抗原特異性基因2.1 血清 O 抗原部分特異性基因 PCR 產(chǎn)物電泳圖（圖 1）M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M

圖 1-1 O 抗原特異性基因 PCR 電泳結(jié)果(左：gtrIV；右：oac)：DL2000； 1：陰性對(duì)照； 2：HN5； 3：2008069； 4：2011178； 5：201002004060； 7：1040； 8：SH12sh017； 9：230408； 10：XJ2006-135； X-C386； 12：GX-C919M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Mbp20001000750500250100M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R516.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2539157