【摘要】：研究背景：瘧疾(Malaria)是危害公眾健康和阻礙社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展一個重要問題,傳播媒介是按蚊(Anopheles)到目前為止,瘧疾不再是不可防治的疾病,人類在瘧疾控制方面取得重大成就之一是傳瘧媒介得到了有效控制。使用浸泡過除蟲菊酯類藥物的蚊帳和室內(nèi)噴灑殺蟲劑是控制蚊媒的主要措施。然而,長期大量使用殺蟲劑在大大削減傳瘧蚊蟲種群密度的同時也改變了其種群結(jié)構(gòu),并引起抗藥性。為了徹底消除瘧疾,研究抗藥機(jī)制勢在必行。 眾所周知,蚊媒對殺蟲劑的抗性機(jī)制主要包含兩大類：代謝解毒和靶標(biāo)敏感性下降。代謝解毒產(chǎn)生的抗藥性(代謝抗藥性)主要是蚊蟲通過體內(nèi)解毒代謝酶基因擴(kuò)增或過量表達(dá),增強(qiáng)解毒代謝酶活性,從而降低殺蟲劑毒性,阻斷殺蟲劑作用到抗性昆蟲的靶標(biāo)。其中,細(xì)胞色素單加氧酶P450氧化酶家族(單加氧酶P450s)、非專一性酯酶系(ESTs)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-S-轉(zhuǎn)移酶系(GSTs)為主要的代謝性解毒酶。靶標(biāo)敏感性降低產(chǎn)生的抗藥性(靶標(biāo)抗藥性)主要是指由于抗性蚊體內(nèi)的殺蟲劑作用靶標(biāo)基因發(fā)生突變,降低了其與殺蟲劑的結(jié)合,從而使蚊蟲對殺蟲劑的敏感性降低而產(chǎn)生的抗性。殺蟲劑對蚊媒作用的靶標(biāo)主要有3種：有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)乙酰膽堿酯酶(AChE); DDT和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)神經(jīng)軸突鈉離子通道(SC)；環(huán)戊二烯類和吡唑類、二環(huán)磷酯類、二環(huán)苯甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)Y-氨基丁酸(GABA)受體-氯離子通道復(fù)合體。 中國的惡性瘧疾發(fā)病主要集中在海南島和云南省。海南島是被30公里寬的瓊州海峽與中國大陸隔離的一個孤島,南部主要為山脈,也是曾經(jīng)全島瘧疾流行的高發(fā)區(qū)域。海南島主要以種植水稻為主,一年三季,水稻田有利于傳瘧按蚊的孳生。十年前,微小按蚊(Anopheles minimums)作為海南島主要傳播瘧疾的蚊媒,經(jīng)過大量殺蟲劑的使用已經(jīng)得到了很好的控制,其種群幾乎滅絕。而中華按蚊(Anopheles sinensis)、棋斑按蚊(Anopheles tessellatus)、迷走按蚊(Anopheles vagus)等其他傳播瘧疾的蚊媒種群卻在十年后的今天大量被報(bào)道。為了徹底控制海南島傳瘧媒介,本課題對目前海南島主要傳瘧媒介的種群密度、對殺蟲劑的抗藥性及其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了如下研究： 一、研究方法： 1.海南島主要傳瘧蚊媒種群密度及殺蟲劑使用情況調(diào)查 2012年7月到8月,根據(jù)海南島不同的地勢和海拔,對海南島12個地點(diǎn)傳瘧蚊媒種群密度進(jìn)行了調(diào)查,最后在臨高、陵水、文昌、澄邁、定安、屯昌、保亭和三亞8個調(diào)查點(diǎn)收集到了研究所需的按蚊幼蟲、蛹和成蟲,我們按照采集到的幼蟲數(shù)量研究種群密度。采集到的主要傳瘧按蚊有三種：中華按蚊、棋斑按蚊和迷走按蚊。幼蟲采集采用幼蟲勺定點(diǎn)撈法,在采集點(diǎn)隨機(jī)選取5個按蚊孳生地,采用5個孳生地的350m1勺子舀水中所含幼蟲個數(shù)的平均數(shù)計(jì)為幼蟲的密度。所有幼蟲均采自水稻田。成蟲采集自農(nóng)戶家中�；蜇i圈內(nèi),用專用吸蚊器吸取,取單位時間內(nèi)捕捉到的成蟲個數(shù),除以單位時間的平均數(shù)計(jì)為當(dāng)?shù)爻晌玫拿芏�。蚊種的鑒定方面,我們主要根據(jù)幼蟲室內(nèi)孵化為成蚊肉眼形態(tài)觀察和實(shí)驗(yàn)室PCR擴(kuò)增蚊ITS2和28S D3區(qū)域確定。在采集樣本的同時,我們詢問農(nóng)戶及周邊出售農(nóng)藥的供銷社調(diào)查海南目前各地使用的農(nóng)藥。 2.海南島主要傳瘧蚊媒殺蟲劑抗性的生物學(xué)測定 我們采用WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)成蚊筒內(nèi)藥膜接觸法進(jìn)行生物學(xué)活性測定。藥膜采用WHO規(guī)定的濃度：溴氰菊酯0.05%,DDT4.0%和馬拉硫磷5%,同時制備對照組藥膜(均由中國CDC提供)。測試按蚊為我們從海南8個地點(diǎn)采集的幼蟲和蛹進(jìn)行室內(nèi)孵化培養(yǎng),選取羽化后三天的未吸血雌蚊,20只為一批,每個地點(diǎn)每種藥膜均測定5批,一個地點(diǎn)的一種藥物選用一張對照藥膜測試20只未吸血的雌蚊作為對照。操作方法參照由中國標(biāo)準(zhǔn)出版社出版的《蚊蟲抗藥性檢測方法生物測定法(GB/T26347-2010)》：分別取20只未吸血的雌蚊吸入裝有實(shí)驗(yàn)藥膜和對照藥膜的接觸筒中,觀察第10、15、20、30、40、50和60分鐘被擊倒的蚊蟲個數(shù),并記錄首次擊倒時間。1蚊蟲小時后仍未被擊倒的蚊蟲轉(zhuǎn)入恢復(fù)筒,用8%的葡萄糖溶液喂養(yǎng),觀察24小時后繼續(xù)存活的蚊蟲為殺蟲劑抗性蚊,24小時內(nèi)被擊倒的蚊蟲則為殺蟲劑敏感蚊。根據(jù)擊倒順序標(biāo)記每只蚊蟲,擊倒和存活的每只蚊蟲單管保存在1.5ml EP管內(nèi),-20℃保存?zhèn)溆谩?3.海南島主要傳瘧蚊媒代謝解毒酶活性測定 3.1KP04蚊酶液制備 在冰上取下每只蚊蟲的頭和足,放入裝有2000L無水乙醇的0.5mL EP管內(nèi),按照原來的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記,-20℃保存。將每只蚊蟲的剩余部分在試管內(nèi)加入3000LKPO4(0.25M)緩沖液在冰上充分研磨,1,3000rpm離心5分鐘后取上清液轉(zhuǎn)入2.0mL EP管內(nèi),并用KP04緩沖液稀釋至1.5mL,即為蚊蟲酶液。殘?jiān)尤?00p L無水乙醇,也按照原來的標(biāo)記對應(yīng)標(biāo)記-20℃保存。蚊蟲酶液用于測定谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶(GST)、單加氧酶P450、羧酸酯酶(COE,又名CES)代謝解毒酶活性測定及蛋白含量。 3.2蛋白含量的測定 取單只蚊蟲的40μ L蚊酶液移入一次性比色杯(d=1),再取0.25M KPO4緩沖液40pL移入另一只一次性比色杯作為空白對照。分別加入9000L考馬斯亮藍(lán)染色液,5分鐘后分別在波長為595nm的分光光度計(jì)上讀取OD值兩次。兩次讀數(shù)的平均值(即平均OD值)分別代入根據(jù)牛血清白蛋白制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=28.977X2-22.201X+5.1657計(jì)算蛋白含量,其中,X為OD,Y為蛋白含量。實(shí)驗(yàn)樣品與空白對照之差即為所測40uL蚊酶液的蛋白含量。然后根據(jù)公式M=Y×1500/4000計(jì)算單只蚊蟲的總蛋白含量M(單位：mg)。該數(shù)值用于三種酶活性最終計(jì)算。 3.3谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)酶活性的測定 將蚊蟲酶液、GST緩沖液、1-氯-2,4-二硝基笨(cDNB)緩沖液各2000L混合加入一次性比色杯內(nèi),同時將0.25M KP04緩沖液、GST緩沖液、1-氯-2,4-二硝基笨(cDNB)緩沖液各2000L混合加入另一只一次性比色杯內(nèi)作為空白對照,分別在波長為340nm的分光光度計(jì)上讀取OD值4次,每次間隔2-4分鐘。記錄每次讀取的時間和每次讀取的OD值。兩次OD讀數(shù)之差除以間隔時間獲得每分鐘0D變化值。四次讀數(shù)標(biāo)記為1,2,3,4,按照讀數(shù)4-1,4-2,4-3,3-1,3-2,2-1的順序各自除以間隔時間得到6個數(shù)值。用實(shí)驗(yàn)樣品的平均值減去空白對照的平均值,即獲得校正后的實(shí)驗(yàn)樣品每分鐘OD變化值。然后根據(jù)每只蚊蟲總蛋白含量計(jì)算出其GST酶活性值(單位：μmol cDNB/min/mg protein)。共測得956個樣本的GST酶活性。 3.4單加氧酶P450酶活性的測定 在一次性比色杯中加入350pL蚊蟲酶液和8μL7-4-乙氧基香豆素(7EC)同時取0.25M KP04緩沖液350pL代替蚊蟲酶液與8μL7EC加入另一只比色杯中作為空白對照,然后在30℃水浴培養(yǎng)4小時。分別加入560pL氨基乙酸緩沖液,在波長調(diào)至450nm的分光光度計(jì)上讀取OD值兩次。然后將實(shí)驗(yàn)樣品將兩次OD讀數(shù)的平均值減去空白對照的平均值得到校正后的蚊蟲酶液的OD值,再除以水浴培養(yǎng)的時間獲得每分鐘蚊蟲酶液OD的變化值。所有操作重復(fù)一次。然后,取兩遍操作獲得的OD變化值的平均值作為該蚊蟲最后的OD變化值；再根據(jù)7-3-羥基香豆素(7-HC)制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=88.470D+4.88計(jì)算出最后的單加氧酶P450酶活性值(單位：7-HC/min/mg protein)。共測得938個樣本的P450酶活性。 3.5羧酸酯酶(COE)酶活性的測定 取900pL對硝基苯基醋酸鹽緩沖液放入1.5ml EP管內(nèi),30℃水浴培養(yǎng)5分鐘,加入100pL蚊蟲酶液13,000轉(zhuǎn)離心5秒,轉(zhuǎn)入比色杯中在分光光度計(jì)405nm波長處讀取OD值,測定讀取兩遍,所有操作重復(fù)一次。同時將0.25M KP04緩沖液100pL代替蚊蟲酶液重復(fù)上述操作獲得空白對照的OD值。將然后將實(shí)驗(yàn)樣品將兩次OD讀數(shù)的平均值減去空白對照的平均值得到校正后的蚊蟲酶液的OD值,再除以水浴培養(yǎng)的時間獲得每分鐘蚊蟲酶液OD值。所有操作重復(fù)一次。然后,取兩遍操作獲得的OD值的平均值作為該蚊蟲最后的OD變化值。根據(jù)公式0D/(16.4X0.05×protein(mg/mL))×1000計(jì)算出最終COE酶活性值(單位：nmoL/min/mg protein)。共測得903個樣本的COE酶活性。 4.海南島主要傳瘧蚊媒靶標(biāo)抗性測定 溴氰菊酯和DDT作用的靶標(biāo)為神經(jīng)軸突鈉離子通道,而馬拉硫磷作用靶標(biāo)為乙酰膽堿酯酶(AChE),因此我們對前者進(jìn)行擊倒抗性(Knockdown resistance, Kdr)靶標(biāo)L1014位點(diǎn)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),對后者進(jìn)行PCR-RFLP檢測Ace-1靶標(biāo)G119位點(diǎn)基因?qū)嶒?yàn)。共用150只迷走按蚊、137只中華按蚊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。蚊蟲DNA采用專用試劑盒提取,按說明操作。 4.1擊倒抗性(Knockdown resistance, Kdr)靶標(biāo)L1014位點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) Para鈉離子通道具有快速擊倒效應(yīng),昆蟲對此產(chǎn)生的抗藥性稱為擊倒抗藥性(Knock down resisters, Kdr)。按蚊最常見的是位于通道第二功能區(qū)的S6疏水區(qū)1014位點(diǎn)的亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?LeuyPhe)、絲氨酸(serine)、半胱氨酸(cysteine)等,即L1014F、L1014S.L1014C三個位點(diǎn)的突變,我們重點(diǎn)檢測L1014位點(diǎn)的突變。采用PCR擴(kuò)增中華按蚊,其引物5’→3’為Kdr-F1023(TGCCACTCCGTGTGTTTAGA)和Kdr-R1347(GAGCGATGATGATCCGAAAT)的S6區(qū)域,目的片段大小為325bp, PCR反應(yīng)條件為：反應(yīng)條件為94℃C初始變性3分鐘,(94℃變性1分鐘,50℃復(fù)性30秒,72℃延伸30秒)×45個循環(huán),72℃最后延伸10分鐘。產(chǎn)物通過凝膠電泳檢測并測序。迷走按蚊采用引物Agdlmi-F和Agd2h-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件僅改變復(fù)性溫度50℃為47℃。 4.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測Ace-1靶標(biāo)G119區(qū)域?qū)嶒?yàn) PCR擴(kuò)增中華按蚊和迷走按蚊G119區(qū)域,觀察是否發(fā)生突變。所用引物5’→3’為Ace-1-F22F(TAGGTCACGGTGAGTCCGYA)和Ace-1-R660(ACCACGATCACGTTCTCCTC),反應(yīng)條件為94℃初始變性3分鐘,(94℃變性45秒,55℃復(fù)性30秒,72℃延伸30秒)×35個循環(huán),72℃C最后延伸5分鐘。2.5%凝膠電泳測得中華按蚊產(chǎn)物為602bp,迷走按蚊產(chǎn)物為571bp。所得產(chǎn)物繼續(xù)加入AIM限制性核酸酶進(jìn)行反應(yīng)(按AIU1限制性核酸酶試劑盒說明書操作),若為純合型(AGC/AGC),將得到118bp和75bp兩條產(chǎn)物,若為野生型(GGC/GGC),只有193bp一條產(chǎn)物,若為雜合型(GGC/AGC),將得到193bp,118bp和75bp三條產(chǎn)物。根據(jù)突變個數(shù)計(jì)算突變頻率。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。蚊蟲的死亡率根據(jù)每個蚊蟲種群接觸每種殺蟲劑24小時后的死亡數(shù)量進(jìn)行計(jì)算。以蚊蟲接觸無殺蟲劑但有對應(yīng)溶劑的空白膜為對照進(jìn)行校正。將每個重復(fù)校正后的死亡率用于計(jì)算每個蚊蟲種群對每種殺蟲劑處理后蚊蟲的平均死亡率和標(biāo)準(zhǔn)差。將每個種群每種殺蟲劑處理后24小時內(nèi)死亡的蚊蟲分為敏感性蚊蟲(敏感組S),24小時后活著的蚊蟲分為抗藥性蚊蟲(抗性組R)。用卡方檢驗(yàn)(Chi-square)或Fisher確切概率檢驗(yàn)分析蚊蟲抗藥性與基因突變(kdr靶標(biāo)L1014位點(diǎn)和ace-1靶標(biāo)G119位點(diǎn)基因)的關(guān)聯(lián)。用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析抗性組與敏感組蚊蟲酶活性的差異。當(dāng)P0.05時有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時計(jì)算每個蚊蟲種群對每種殺蟲劑處理后獲得的抗性組與敏感組蚊蟲酶活性之比值(R/S ratio),抗性組與敏感組比值的標(biāo)準(zhǔn)差用下列公式計(jì)算：SD=SQRT[(SDR/MR)2+(SDs/Ms)2]. 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.海南島主要傳瘧媒介種群密度及使用殺蟲劑調(diào)查結(jié)果 在海南島8個點(diǎn)中,中華按蚊主要分布在三亞(0.923±0.280條/勺)和保亭(1.056±0.665條/勺)；棋斑按蚊主要分布在三亞(1.979±1.470條/勺)、保亭(4.572±1.855條/勺)和陵水(1.143±0.595條/勺)；迷走按蚊主要分布在海南島北部,其中澄邁(1.363±0.980條/勺)、臨高(1.012±0.595條/勺)、定安(1.275±0.175條/勺)、屯昌(1.099±0.420條/勺)和文昌(4.792±1.085條/勺)均有分布。 海南島各地殺蟲劑的使用情況：除蟲菊酯類如溴氰菊酯、甲醚菊酯、高效氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、氯氰菊酯等在采樣的8個點(diǎn)均有使用。有機(jī)磷酸類如三唑磷等在保亭、臨高、屯昌均有使用。中國政府一直禁用的有機(jī)氯類如DDT,卻在保亭、定安、文昌發(fā)現(xiàn)使用。其他的殺蟲劑如煙堿類藥物吡蟲啉發(fā)現(xiàn)在三亞、保亭、澄邁、文昌使用。 2.海南島主要傳瘧媒介生物學(xué)活性的測定結(jié)果 因采集的按蚊幼蟲孵化為成蚊數(shù)量不足,本研究根據(jù)各地樣本成蚊孵化數(shù)量及各地殺蟲劑使用情況,選擇性的在不同的地點(diǎn)用不同的藥膜進(jìn)行了生物測定。不同地點(diǎn)不同藥膜對照組的致死率均為0。生物學(xué)活性共測定1725個樣本,各點(diǎn)各藥膜測定結(jié)果如下： 2.10.05%溴氰菊酯的測試結(jié)果 中華按蚊具有初步抗性,尤其在三亞(85.78%±17.54%)、保亭(90.98%±9.39%)。在澄邁(97.87%±4.31%)、定安(100%),迷走按蚊為敏感群。棋斑按蚊也為敏感群,其中在三亞和陵水,蚊蟲在0.05%溴氰菊酯測試中死亡率均為100%。 2.24%DDT的測試結(jié)果 中華按蚊具有抗性：三亞(78.38%±15.83%)、保亭(72.71%±21.20%)。迷走按蚊在屯昌(67.06%±7.54%)具有抗性,在澄邁(84.00%±11.68%)、定安(88.82%±10.07%)具有初步抗性。 2.35%馬拉硫磷測試結(jié)果 迷走按蚊具有初步抗性：定安(77.29%±10.57%)、澄邁(88.87%±4.26%)、屯昌(78.86%±9.49%)。 3.海南島主要傳瘧媒介代謝解毒酶活性測定結(jié)果 3.1谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)酶活性測定結(jié)果 GST酶對定安采集的迷走按蚊抗5%馬拉硫磷的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(R/S=1.1361±0.3145,t=2.806,P=0.0060),對屯昌采集的迷走按蚊抗5%馬拉硫磷影響亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(R/S=1.1141±0.1853,t=2.501,P=0.0150)。 3.2單加氧酶(P450)酶活性測定結(jié)果 單加氧酶P450酶對三亞采集的中華按蚊抗0.05%溴氰菊酯影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(R/S=1.5391±0.8130,t=2.738,P=0.0076),單加氧酶P450酶活性對保亭采集的中華按蚊抗0.05%溴氰菊酯(R/S=1.5278±0.6072,t=2.575,P=0.0115),保亭(R/S=1.2662±0.7366,t=2.145,P=0.0346)和三亞(R/S=1.2732±0.5853,t=2.317,P=0.0226)采集的中華按蚊抗4%DDT,定安采集的迷走按蚊抗5%馬拉硫磷(R/S=1.3143±0.7058,t=2.417,P=0.0175)影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.3羧酸酯酶(COE)酶活性測定結(jié)果 COE酶活性對三亞采集的中華按蚊抗0.05%溴氰菊酯(R/S=1.2580±0.3507,t=3.478,P=0.0010)影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對保亭采集的中華按蚊抗0.05%溴氰菊酯(R/S=1.2738±0.4677,t=2.009,P=0.0470)影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.海南島主要傳瘧媒介靶標(biāo)抗性測定結(jié)果 4.1擊倒抗性(Knockdown resistance, KDR)靶標(biāo)驗(yàn)證結(jié)果 中華按蚊抗溴氰菊酯(三亞采集,突變頻率7.5%,P=0.0250.05),抗DDT(三亞采集,突變頻率為9.5%,P=0.0150.05)、(保亭采集,突變頻率為7.8%,P=0.0110.05)Para鈉離子第二功能區(qū)的S6疏水區(qū)1014位點(diǎn)的亮氨酸發(fā)生突變?yōu)楸奖彼?L1014),中華按蚊抗DDT可能與其抗性有關(guān)。迷走按蚊未發(fā)現(xiàn)L1014位點(diǎn)突變。 4.2PCR-RFLP檢測Ace-1靶標(biāo)G119位點(diǎn)基因?qū)嶒?yàn) 我們發(fā)現(xiàn)迷走按蚊G119位點(diǎn)未發(fā)生突變,中華按蚊在各地采集的抗馬拉硫磷與敏感蚊蟲G119位點(diǎn)均有突變,突變頻率在53%到72%之間,有抗性的蚊蟲突變頻率略高于敏感蚊蟲。迷走按蚊均未發(fā)生G119位點(diǎn)突變。 三、結(jié)論 1.海南島在7、8月間主要傳瘧按蚊為中華按蚊、迷走按蚊和棋斑按蚊,在海南島南部主要傳瘧媒介以中華按蚊和棋斑按蚊種群為主,北部主要以迷走按蚊分布為主。除蟲菊酯類殺蟲劑在海南應(yīng)用最為廣泛。 2.生物學(xué)活性測定結(jié)果表明海南島中華按蚊(保亭和三亞)對溴氰菊酯具有初步抗性,中華按蚊、迷走按蚊對DDT具有初步抗性,迷走按蚊(澄邁、定安、屯昌)對馬拉硫磷具有初步抗性。PCR-RFLP檢測Ace-1靶標(biāo)G119位點(diǎn)基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明,中華按蚊(保亭和三亞)對馬拉硫磷有初步抗性。 3.海南中華按蚊和迷走按蚊代謝性解毒酶活性和分子生物學(xué)擊倒抗性實(shí)驗(yàn)(Kdr)測試結(jié)果表明,代謝性解毒酶產(chǎn)生抗藥性機(jī)制的在海南較為普遍。由于擊倒抗性實(shí)驗(yàn)我們只在海南的中華按蚊中發(fā)現(xiàn)有L1014位點(diǎn)的突變,突變類型為L1014F,說明迷走按蚊的抗藥性機(jī)制只與代謝性解毒酶的活性有關(guān)。而中華按蚊抗藥性可能是酶生物學(xué)活性和靶標(biāo)基因發(fā)生突變共同作用的結(jié)果。
【圖文】：

博上學(xué)位論文 浮與水面。按蚊踴呼吸管比庫蚊的粗短，口寬。用水桶裝回農(nóng)田中的水帶回駐地用于培養(yǎng)幼蟲和岐蛹。夜晚9點(diǎn)我們選擇到養(yǎng)牛和豬的農(nóng)戶家中，待蚊蟲吸完血休息時，用專用的吸蚊器到牛圈或豬圈采集成蚊，放入自制的簡易蚊籠帶回駐地。按蚊成蚊的停落姿勢不同于庫蚊和伊蚊，按岐停落姿勢與墻壁呈45度，蚊卩彖與其身體呈一直線，，像針一樣扎在墻壁上。在采集樣本的同時，我們詢問農(nóng)戶及周邊出售農(nóng)藥的供銷社調(diào)查海南目前各地使用的農(nóng)藥。

博上學(xué)位論文 因課題需要，各點(diǎn)至少需要120只由幼蟲■化，羽化后三天未吸血的雌蚊/每種藥膜，而按敗的幼蟲培養(yǎng)為成妓很難，因此必須在采集點(diǎn)收集到足夠數(shù)量（至少1000條左右）的幼蟲樣本，才能繼續(xù)后續(xù)試驗(yàn)。最后在臨高、陵水、文昌、澄邁、定安、屯昌、保亭和三亞8個點(diǎn)，收集到了足夠數(shù)量的幼蟲，我們根據(jù)幼蟲在各點(diǎn)懫集到的數(shù)量進(jìn)行了密度統(tǒng)計(jì)。采樣分布圖見1-2，各采集點(diǎn)GPS定位的經(jīng)維度見表1-3。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R531.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 胡小邦,朱昌亮;昆蟲抗藥性機(jī)制研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊);2004年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 武松;西藏瘧疾流行區(qū)多斑按蚊復(fù)合體傳瘧作用與分子生物學(xué)研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2009年

本文編號：2536354