【摘要】：目的： (1)當(dāng)前有很多研究報道顯示病毒編碼的miRNAs在病毒復(fù)制以及病毒與宿主之間的相互作用中發(fā)揮著重要作用。然而關(guān)于來源于HIV-1的TAR元件的miR-TAR-3p是否表達及其在病毒復(fù)制中的功能研究卻很少有文章報道。由此,本文試圖研究HIV-1編碼的miR-TAR-3p在HIV-1感染的人外周血單核細胞衍生的巨噬細胞(Monocyte-derived macrophages, MDM)中的表達及其在HIV-1復(fù)制中的作用。(2) MALAT1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript)是腫瘤中一種常見長鏈非編碼RNA,很少有文獻報道MALAT1在外周血分離的MDM中的研究,我們試圖利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究MDM中的長鏈非編碼RNAMALAT1的功能以及分子機制,而MDM又是HIV-1的靶細胞,我們試圖研究MALAT1在HIV-1感染的MDM中的作用。方法：(1)首先利用RT-qPCR檢測miR-TAR-3p在HIV-1感染的患者外周血以及MDM中的表達；然后利用合成的miR-TAR-3p mimics和miRNA inhibitor轉(zhuǎn)染進MDM后檢測gag基因和p24蛋白的表達;并利用熒光素酶報告基因檢測miR-TAR-3p對HIV-1轉(zhuǎn)錄的影響；之后再用細胞因子芯片檢測miR-TAR-3p對巨噬細胞中細胞因子的影響；最后利用熒光素酶報告基因試驗檢測HIV-1編碼的其他miRNAs對HIV-1轉(zhuǎn)錄的影響。 (2)首先利用RT-qPCR證實MALAT1在MDM中的表達；接著利用蛋白質(zhì)組學(xué)檢測MDM中MALAT1調(diào)控的所有蛋白表達以及相關(guān)功能情況；然后利用RT-qPCR檢測HIV-1感染之后長鏈非編碼RNA MALAT1和抗病毒miR-125b的表達量變化；最后轉(zhuǎn)染MALAT1 siRNA之后,檢測MDM中MALAT1和抗HIV-1感染的miR-125b的表達情況。結(jié)果： (1)我們檢測到HIV-1感染病人外周血中以及細胞模型中有miR-TAR-3p的表達。合成的miR-TAR-3p mimics明顯抑制HIV-1在巨噬細胞中的復(fù)制,合成的miR-TAR-3p Inhibitor mimics明顯促進了HIV-1在巨噬細胞中的復(fù)制。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示miR-TAR-3p通過結(jié)合5'LTR的TAR元件來抑制HIV-1的轉(zhuǎn)錄。利用細胞因子芯片技術(shù)來篩選有表達變化的細胞因子時,沒有發(fā)現(xiàn)有明顯變化的細胞因子。HIV-1編碼的miR-N367以及miR-TAR-3p可以抑制HIV-1基因組的轉(zhuǎn)錄,而miR-H1對HIV-I基因組的轉(zhuǎn)錄沒有影響。(2)RT-qPCR結(jié)果顯示長鏈非編碼RNA MALAT1在MDM中有表達。利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究MALAT1調(diào)控的蛋白,總共鑒定到4709個蛋白,包括26個上調(diào)的差異蛋白和51個下調(diào)的差異蛋白,其中STAT1的表達量明顯下調(diào),GO功能注釋顯示和signaling, viral reproduction相關(guān)。HIV-1感染的MDM中MALAT1表達量上升,而miR-125b表達量下降。干擾MALAT1表達的MDM中,STAT1表達量下降,miR-125b表達量上升。結(jié)論：(1)我們的研究揭示了HIV-1編碼的miR-TAR-3p存在于HIV-1感染的病人外周血以及巨噬細胞中,功能研究顯示miR-TAR-3p可能作為負調(diào)控因子調(diào)控HIV-1的復(fù)制。 (2)我們的研究發(fā)現(xiàn)MALAT1在巨噬細胞中可能發(fā)揮著重要的抗病毒免疫作用,也發(fā)現(xiàn)MALAT1在HIV-1感染中可能扮演重要角色。這可能對于后期利用MALAT1作為一個HIV-1潛在的治療靶點提供理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

從外周血分離出ＰＢＭＣ之后，利用ＧＭ－ＣＳＦ刺激單核細胞Ｍｏｎｏｃｙｔｅ分化到逡逑巨枿細胞ＭＤＭ，培養(yǎng)５－７ｄ之后，利用流式細胞術(shù)ＦＡＣＳ檢測ＭＤＭ的陽性純化逡逑率，結(jié)果如圖１Ａ所示，超過９９％的細胞都是ＭＤＭ陽性細胞。分離得到ＭＤＭ逡逑之后，利用ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ毒株感染ＭＤＭ，結(jié)果如圖１Ｂ所示，隨著感染天數(shù)的延長，逡逑ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ毒株感染的巨嗤細胞ｐ２４蛋白表達量也逐漸上升，到感染第１５ｄ的時逡逑候，ｐ２４蛋白的表達量己經(jīng)到？６０ｐｇ／ｍｌ。與此同時，我們觀察到ＨＩＶ－１感染的巨逡逑枿細胞中有合胞體的形成，而且隨著感染天數(shù)的延長，合胞體越來崣多。逡逑為了進一步確認ＨＩＶ－１感染的巨枿細胞會誘導(dǎo)合胞體的形成，在ＨＩＶ－１感染逡逑第９ｄ的時候，利用Ｈｏ濁ｅｓｔ染色的試驗方法，發(fā)現(xiàn)在ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ感染的巨幢細胞逡逑中，觀察到有合胞體的形成。在未感染的正常對照巨枿細胞中

第９ｄ的時候，利用Ｈｏ濁ｅｓｔ染色的試驗方法，發(fā)現(xiàn)在ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ感染的巨幢細胞逡逑中，觀察到有合胞體的形成。在未感染的正常對照巨枿細胞中，沒有觀察到合胞逡逑體的形成（如圖２Ａ所示）。為了進一步確認該結(jié)果，通過換用不同的視野觀察，逡逑在（Ｘ２００）邋（Ｘ４００）倍巧光顯微鏡下分別觀察照相，均看到合胞體的形成（如圖逡逑２Ｂ所示）。逡逑這些實驗結(jié)果說明我們成功建立了邋ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ毒株感染人外周血單核細胞衍逡逑生巨幢細胞ＭＤＭ的模型。逡逑３N２邋ＨＩＶ－１邋ＮＬ４－３毒株感染人的原代ＣＤ４＋Ｔ細胞模型的建立逡逑從人外周血分離到ＰＢＭＣ之后，我們試圖建立ＨＩＶ－１感染人的原代ＣＤ４＋Ｔ逡逑細胞的模型。由于ＣＤ４＋Ｔ細胞與ＭＤＭ的受體不同，需要利用能夠感染Ｔ細胞逡逑的ＨＩＶ－１毒株ＮＬ４－３。因此，要建立此模型，首先將ＰＮＬ４－３質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至２９３Ｔ逡逑細胞。然后收集上清ＨＩＶ－１邋ＮＬ４－３毒株感染人的原代ＣＤ４＋Ｔ細胞。如圖３Ａ所逡逑示，感染第０天，無ＨＩＶ－１感染時，ＨＩＶ－１邋ｇａｇ基因的表達量為０，隨著感染天逡逑數(shù)的X椉櫻齲桑鄭鋇模紓幔緇虻謀澩锪恐鸞ピ黽印＝酉呂�，訑S茫牛蹋桑櫻良觳忮義锨鄭卞澹危蹋矗沖澹穡玻吹鞍椎謀澩鎪劍繽跡常濾荊蓿齲桑鄭備腥臼�，｝x桑鄭卞澹穡玻村義系鞍椎謀澩锪課

本文編號：2518461