【摘要】：甲型H1N1流感病毒感染人體能夠造成嚴(yán)重的急性肺損傷,具有較高的發(fā)病率和致死率。甲流感染伴有多種細(xì)胞因子水平升高,這些因子在肺損傷中的作用機制也陸續(xù)被揭示。有研究發(fā)現(xiàn),在多個組織損傷和炎癥模型中均檢測到有FGF2細(xì)胞因子水平升高,然而目前關(guān)于FGF2在流感誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用機制還未曾有報道。FGF2是一個多效性的細(xì)胞因子,不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成,而且參與組織損傷修復(fù),誘導(dǎo)胚胎發(fā)育等多種生物學(xué)過程。本研究試圖探究FGF2在甲型H1N1流感病毒感染引起的急性肺損傷中的作用機制。首先分析了甲型H1N1流感患者體內(nèi)以及甲型H1N1流感病毒(A/Beijing/501/2009)感染致小鼠肺損傷模型中FGF2分子的表達(dá)水平,結(jié)果表明甲流患者血清中FGF2水平顯著高于正常人群,在小鼠肺泡灌洗液中FGF2的水平呈顯著上升趨勢。A/Beijing/501/2009感染致小鼠肺損傷模型中,用FGF2中和抗體干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)小鼠肺損傷更為嚴(yán)重,體重和存活率下降,其中早期抗體干預(yù)比晚期干預(yù)小鼠發(fā)病更為嚴(yán)重。同樣的,FGF2缺陷小鼠表現(xiàn)出對A/Beijing/501/2009以及A/Puerto Rico/8/1934流感病毒更為易感,小鼠肺損傷更重、死亡率更高。相反,用FGF2重組蛋白給藥后,小鼠病情減輕,存活率明顯上升。以上這些結(jié)果表明,FGF2在甲型H1N1流感病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷中起保護(hù)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),FGF2缺陷小鼠感染甲型H1N1流感病毒后,早期肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞的募集量明顯少于野生型小鼠,其中主要以中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主。同時還發(fā)現(xiàn),在FGF2缺陷小鼠肺泡灌洗液中,多種細(xì)胞因子水平顯著低于野生型小鼠,綜合表現(xiàn)出FGF2敲除后不能激發(fā)有效的保護(hù)性炎癥應(yīng)答。以上結(jié)果預(yù)示著FGF2敲除后這些有差異的炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子可能在流感感染致小鼠死亡的早期發(fā)揮著重要的保護(hù)功能。此外,在FGF2缺陷小鼠肺組織中檢測到較高的病毒載量,而FGF2給藥治療能夠降低小鼠肺部病毒載量。最后,我們還發(fā)現(xiàn)FGF2主要分泌細(xì)胞來源是肺上皮細(xì)胞,而非中性粒細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞。進(jìn)一步研究FGF2介導(dǎo)的肺損傷中下游信號通路發(fā)現(xiàn),FGF2極有可能參與了P38介導(dǎo)的MAPK信號通路,預(yù)示著該信號通路的激活很可能在保護(hù)小鼠感染緩解肺損傷中發(fā)揮重要作用。近年來,關(guān)于mi RNA和炎癥應(yīng)答關(guān)系的研究已經(jīng)成為感染免疫中研究的熱點,但目前對于mi RNA在甲型H1N1流感病毒感染中的作用機制仍然知之甚少。是否存在關(guān)鍵的mi RNA在甲型H1N1流感病毒感染中發(fā)揮重要功能還不得而知。通過檢測甲型H1N1流感病毒感染誘導(dǎo)mi RNA的表達(dá)水平,我們發(fā)現(xiàn)甲型H1N1流感病毒感染能夠造成mi RNAs表達(dá)紊亂。將表達(dá)顯著下調(diào)的mi RNA對FGF2靶基因進(jìn)行預(yù)測,篩選并驗證了能夠顯著抑制FGF2基因表達(dá)的mi RNA,包括mi R-194-5p、mi R-25-3p、mi R-92b-3p、mi R-361-5p、mi R-15b-5p、mi R-22-3p、mi R-17-5p、mi R-503-5p和mi R-16-5p。進(jìn)一步驗證抑制倍數(shù)在2倍以上的mi RNA對FGF2 3’UTR的作用,我們構(gòu)建了6個FGF2 3’UTR短片段,分別檢測了對應(yīng)mi RNA的作用,同時我們也構(gòu)建了每個mi RNA在3’UTR上對應(yīng)的突變質(zhì)粒,找到了mi RNA與FGF2 3’UTR的具體結(jié)合位點。研究發(fā)現(xiàn)mi R-194-5p、mi R-361-5p、mi R-92b-3p、mi R-25a-3p、mi R-16-5p、mi R-15a-5p、mi R-15b-5p和mi R-503-5p這8個mi RNA與FGF2 3’UTR有直接的作用,而作用位點即每個mi RNA對應(yīng)的3’UTR上突變的位點。此外,在細(xì)胞和小鼠模型中驗證了這些mi RNA的表達(dá)水平,并且驗證了這些mi RNA的功能,找到了關(guān)鍵的mi RNA調(diào)節(jié)FGF2介導(dǎo)的肺損傷保護(hù)過程,而mi RNA的拮抗劑又能夠治療流感感染引起的小鼠肺損傷,因此,研究mi RNA也為甲型H1N1流感病毒感染造成急性肺損傷的治療提供了新的研究方向。分泌型FGF2與細(xì)胞表面高親和力受體(FGFR)結(jié)合后,能夠促進(jìn)受體二聚化,激活胞內(nèi)酪氨酸激酶活性,導(dǎo)致下游多條信號通路的活化。FGFR包括FGFR1-4四個成員,屬于酪氨酸激酶受體亞家族。有研究發(fā)現(xiàn)用廣譜酪氨酸激酶抑制劑能夠促進(jìn)流感病毒的復(fù)制,然而FGFR家族各成員是否也參與了流感病毒的復(fù)制還不是很清楚,它們是否參與了FGF2介導(dǎo)的肺損傷保護(hù)機制也有待研究。我們用甲型H1N1流感病毒(PR8和H5N1)感染人肺上皮細(xì)胞A549,檢測了四種受體成員的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)FGFR1和FGFR4表達(dá)豐度較高,而FGFR2和FGFR3表達(dá)相對較少,病毒感染后造成FGFR1和FGFR4表達(dá)顯著下調(diào)。進(jìn)一步用si RNA介導(dǎo)的基因表達(dá)沉默,確定了FGFR1敲除能夠顯著促進(jìn)甲型流感病毒的復(fù)制,而FGFR4卻沒有該效應(yīng)。相反,由慢病毒介導(dǎo)的FGFR1過表達(dá)能夠抑制流感病毒復(fù)制,而FGFR4不具有該效應(yīng)。另外,PR8感染不僅能夠下調(diào)FGFR1蛋白水平,而且能夠下調(diào)其磷酸化水平。用FGFR1選擇性抑制劑PD173074能夠明顯促進(jìn)流感病毒的復(fù)制,說明FGFR1激酶活性對流感病毒復(fù)制有很重要的影響。進(jìn)一步,我們還發(fā)現(xiàn)FGFR1敲除能夠明顯促進(jìn)流感病毒早期侵入,通過研究FGFR1對病毒結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞過程的影響,我們發(fā)現(xiàn)FGFR1對病毒結(jié)合細(xì)胞表面沒有影響,而是對病毒內(nèi)吞過程有抑制作用,這種效應(yīng)在PR8和H5N1上都得到了驗證。我們的研究結(jié)果證明了FGFR1在流感感染過程中的重要作用,提示著該受體很可能參與了FGF2介導(dǎo)的肺損傷保護(hù)機制。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R511.7

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1 李平;;流感病毒感染對兒科住院的影響[J];國外醫(yī)學(xué).流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊;1992年03期

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本文編號：2484156