【摘要】：[目的] 通過檢測替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate, TDF)對體外培養(yǎng)條件下人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells-bone marrow, hBMSC)成骨分化的影響,及TDF干預(yù)下成骨譜系細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)因子的基因表達(dá),探索TDF影響人骨代謝的機制。 [方法] 第一部分1、入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)與成骨分化誘導(dǎo)：體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,給予成骨分化培養(yǎng)基,觀察細(xì)胞增殖和分化情況,應(yīng)用堿性磷酸酶染色和鈣茜素紅染色檢測人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化的過程。2、TDF對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中細(xì)胞增殖和凋亡的影響：根據(jù)不同濃度TDF處理分組：OnM TDF組,50nM TDF組,500nM TDF組,5000nM TDF組。MTT法檢測各組細(xì)胞在培養(yǎng)1-7天的增殖情況；用Annexin VPI染色法和TUNEL法檢測各組細(xì)胞凋亡情況。3、替諾福韋酯對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響：在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3、7、9、10天進行堿性磷酸酶染色,在第10、14、21、28天進行鈣茜素紅染色以檢測各組細(xì)胞成骨分化過程中的礦化狀況。4、替諾福韋酯對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中部分細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響：應(yīng)用realtime-PCR方法檢測各組細(xì)胞中堿性磷酸酶、Ⅰ-型膠原、骨保護素和核因子κB活化因子受體配體(receptor activator for nuclear factor-κB Ligand, RANKL)的基因表達(dá)水平；分析TDF干預(yù)下人源成骨譜系細(xì)胞分泌功能的變化。 第二部分TDF影響人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和功能的機制研究：細(xì)胞分組同實驗二,應(yīng)用realtime-PCR檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)因子的基因表達(dá)水平,分析TDF對人成骨細(xì)胞分化和功能的影響是否通過Wnt/β-catenin經(jīng)典信號介導(dǎo),以及受TDF干擾的關(guān)鍵細(xì)胞因子。 [結(jié)果] 第一部分1、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)可表現(xiàn)出成骨細(xì)胞特征：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可經(jīng)間充質(zhì)干細(xì)胞-成骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)表現(xiàn)出成骨細(xì)胞特性,堿性磷酸酶染色陽性、茜素紅染色可見特征性鈣結(jié)節(jié)形成。2、50nM-500nM TDF對hBMSC增殖和凋亡以及hBMSC分化的成骨譜系細(xì)胞增殖和凋亡無明顯影響：①50nM TDF和500nM TDF對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中細(xì)胞增殖、凋亡無明顯影響；②5000nM TDF顯著抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖,也抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的成骨譜系細(xì)胞增殖。3、50nM-500nMTDF干擾hBMSC的成骨分化過程：①500nM TDF干擾人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過程,表現(xiàn)為堿性磷酸酶染色陽性細(xì)胞百分比減少(17.50+4.40%vs.12.40±2.70%,P=0.005),染色減弱；胞外基質(zhì)礦化異常,茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)多為條索狀,邊緣模糊,很少圓形、類圓形)；②50nM TDF對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中胞外基質(zhì)礦化也有干擾,但作用弱于500nMTDF。4、TDF干擾hBMSC成骨分化過程中細(xì)胞因子的基因表達(dá)：在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中,50nMTDF (8.15±0.7vs.6.89±0.35, P=0.001)和500nM TDF(8.15±0.70vs.4.64±0.45,P=0.000)抑制堿性磷酸酶基因表達(dá),也抑制Ⅰ-型膠原的基因表達(dá)(9.28±0.26vs.2.81±0.17,P=0.000；9.28±0.26vs.1.98±0.15,P=0.000)；而RANKL mRNA在50nMTDF組(4.98±0.20vs.7.89±0.41,P=0.00)和500nM TDF組(4.98±0.20vs.6.82±0.03,P=0.000)表達(dá)水平均升高。 第二部分50nM TDF和500nM TDF干擾人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中LRP5mRNA表達(dá)；50nM TDF(5.01±1.69vs.2.31±0.24, P=0.001)和500nM TDF(5.01±1.69vs.3.39±0.79,P=0.021)均降低β-catenin mRNA表達(dá)。 [結(jié)論] 1、替諾福韋酯對人骨代謝的影響可能是通過抑制成骨細(xì)胞的分化過程以及成骨細(xì)胞功能實現(xiàn)的； 2、Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路參與介導(dǎo)替諾福韋酯對成骨細(xì)胞分化和功能的干擾作用,尤其是LRP5和β-catenin mRNA的異常表達(dá)可能起主要作用。
[Abstract]:[Objective] The effects of tenofovir diil fu (TDF) on the osteogenesis and differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBMSC) in vitro were investigated. A machine for exploring the influence of TDF on human bone metabolism System. [Methods] In-vitro culture and osteogenic differentiation induction of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: human bone marrow mesenchymal stem cells were cultured in vitro, osteogenic differentiation medium was given, and cell proliferation was observed. And the effects of TDF on the proliferation and apoptosis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells during the osteogenesis and differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. M TDF緇，

本文編號：2479557