【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一種古老而漫長的感染性疾病，由其導(dǎo)致的死亡率居全球第二位，給各國尤其是發(fā)展中國家?guī)砹顺林氐呢摀�。�?jù)世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)統(tǒng)計，2007年全球新增結(jié)核病人937萬，因TB死亡人數(shù)達132萬(不包括HIV陽性患者)。新增病例中亞洲和非洲分別占55%和31%，其中中國以130萬新增病例位居第二位，TB防控形勢非常嚴峻。目前，卡介苗(Bacillus Calmette G uerin，BCG)是唯一一種獲得批準的廣泛使用的TB預(yù)防疫苗，對于兒童BCG具有良好的保護效果，但對于成人其保護效果不容樂觀，對于抑制潛伏期結(jié)核的復(fù)發(fā)更是毫無作用。新發(fā)TB患者主要來源于潛伏MTB感染者，，原因在于休眠狀態(tài)MTB的再激活和復(fù)蘇，因此研制新的TB疫苗迫在眉睫。未來的TB疫苗不僅要對剛出生嬰兒以及未感染MTB的人群提供良好的預(yù)防作用，對于已感染MTB但尚未發(fā)病的人群也要具有增強細胞免疫、加速清除MTB的保護作用。 1.目的 檢測藤黃微球菌復(fù)蘇促生長因子結(jié)構(gòu)域（Resuscitation-promoting factor domain，Rpfd）及其兩個突變體（Rpfd1、Rpfd2）刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體及γ干擾素（Interferon γ，IFN-γ）和白細胞介素-2（Interleukin2，IL-2）水平，以評價三種因子的免疫原性。 2.實驗方法和結(jié)果 2.1Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白純化、鑒定 將前期制備含谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase， GST）基因片段重組質(zhì)粒PGEX-4T1-Rpfd、PGEX-4T1-Rpfd1、PGEX-4T1-Rpfd2已轉(zhuǎn)入E. coliDH5α中的感受態(tài)細胞進行活化、轉(zhuǎn)接、誘導(dǎo)，獲取表達產(chǎn)物蛋白，將表達產(chǎn)物蛋白進行純化。應(yīng)用Western-blot方法進行蛋白鑒定，鑒定所表達的蛋白為所需目的蛋白。測定蛋白濃度分別為：Rpfd1.400mg/ml、Rpfd12.438mg/ml、Rpfd23.882mg/ml。 2.2Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的體液免疫應(yīng)答 將Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白采用同源加強免疫的方法免疫小鼠，測定其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體水平。實驗結(jié)果表明Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白均具有很好的免疫原性，能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高效價的抗Rpfd特異性抗體，且三種抗原刺激產(chǎn)生的抗體效價顯著高于BCG免疫組。其中Rpfd2組產(chǎn)生的抗體水平最高，提示其啟動感染宿主體液免疫能力優(yōu)于BCG。使用Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白作為抗原，均能被3種抗體識別，且親合程度趨于一致，說明Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白產(chǎn)生的特異性抗體同Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白之間存在交叉免疫反應(yīng)，提示該三種蛋白產(chǎn)生的特異性抗體有可能同時封閉MTB的5種Rpf樣蛋白，從而達到抑制休眠MTB復(fù)蘇和生長作用。 2.3Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的細胞免疫應(yīng)答 將Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白采用同源加強免疫的方法免疫小鼠，測定小鼠外周血中IFN-γ和IL-2表達水平。用MTB毒株H37Rv攻擊免疫小鼠，測定小鼠外周血中IFN-γ和IL-2表達水平。結(jié)果顯示Rpfd、Rpfd1、Rpfd2具有誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生以IFN-γ、IL-2分泌量明顯增加為主的Th1型免疫應(yīng)答。H37Rv攻擊小鼠后，Rpfd發(fā)揮其促細菌生長作用，使小鼠體內(nèi)MTB大量生長，巨噬細胞吞噬大量MTB后，崩解死亡導(dǎo)致IFN-γ含量明顯下降；而Rpfd1、Rpfd2無促細菌生長作用，巨噬細胞吞噬MTB后，未達到結(jié)核菌負荷過載，巨噬細胞殺滅MTB，同時促進IFN-γ分泌，故IFN-γ量增加。Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白免疫小鼠后，刺激小鼠產(chǎn)生IL-2水平明顯升高，高于BCG免疫組；MTB攻擊免疫小鼠后，三組蛋白免疫組小鼠血清中IL-2檢測量均有下降，Rpfd2蛋白免疫組小鼠血清中IL-2下降尤為明顯，提示IL-2因刺激機體內(nèi)T淋巴細胞增殖，強化細胞保護性免疫而消耗，Rpfd2組更為明顯。 3結(jié)論 Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白具有啟動宿主體液免疫功能及增強宿主細胞免疫功能的雙重作用，可通過激發(fā)宿主細胞免疫防御MTB的感染，通過刺激機體產(chǎn)生特異性抗體封閉體內(nèi)或體外來源的Rpf樣物質(zhì)、從而抑制體內(nèi)處于休眠狀態(tài)的MTB的復(fù)蘇，可成為預(yù)防及治療MTB感染的免疫新策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R52

【參考文獻】

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