【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一種古老而漫長的感染性疾病，由其導(dǎo)致的死亡率居全球第二位，給各國尤其是發(fā)展中國家?guī)砹顺林氐呢?fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)統(tǒng)計，2007年全球新增結(jié)核病人937萬，因TB死亡人數(shù)達(dá)132萬(不包括HIV陽性患者)。新增病例中亞洲和非洲分別占55%和31%，其中中國以130萬新增病例位居第二位，TB防控形勢非常嚴(yán)峻。目前，卡介苗(Bacillus Calmette G uerin，BCG)是唯一一種獲得批準(zhǔn)的廣泛使用的TB預(yù)防疫苗，對于兒童BCG具有良好的保護(hù)效果，但對于成人其保護(hù)效果不容樂觀，對于抑制潛伏期結(jié)核的復(fù)發(fā)更是毫無作用。新發(fā)TB患者主要來源于潛伏MTB感染者，，原因在于休眠狀態(tài)MTB的再激活和復(fù)蘇，因此研制新的TB疫苗迫在眉睫。未來的TB疫苗不僅要對剛出生嬰兒以及未感染MTB的人群提供良好的預(yù)防作用，對于已感染MTB但尚未發(fā)病的人群也要具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫、加速清除MTB的保護(hù)作用。 1.目的 檢測藤黃微球菌復(fù)蘇促生長因子結(jié)構(gòu)域（Resuscitation-promoting factor domain，Rpfd）及其兩個突變體（Rpfd1、Rpfd2）刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體及γ干擾素（Interferon γ，IFN-γ）和白細(xì)胞介素-2（Interleukin2，IL-2）水平，以評價三種因子的免疫原性。 2.實驗方法和結(jié)果 2.1Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白純化、鑒定 將前期制備含谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase， GST）基因片段重組質(zhì)粒PGEX-4T1-Rpfd、PGEX-4T1-Rpfd1、PGEX-4T1-Rpfd2已轉(zhuǎn)入E. coliDH5α中的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行活化、轉(zhuǎn)接、誘導(dǎo)，獲取表達(dá)產(chǎn)物蛋白，將表達(dá)產(chǎn)物蛋白進(jìn)行純化。應(yīng)用Western-blot方法進(jìn)行蛋白鑒定，鑒定所表達(dá)的蛋白為所需目的蛋白。測定蛋白濃度分別為：Rpfd1.400mg/ml、Rpfd12.438mg/ml、Rpfd23.882mg/ml。 2.2Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的體液免疫應(yīng)答 將Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白采用同源加強(qiáng)免疫的方法免疫小鼠，測定其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體水平。實驗結(jié)果表明Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白均具有很好的免疫原性，能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高效價的抗Rpfd特異性抗體，且三種抗原刺激產(chǎn)生的抗體效價顯著高于BCG免疫組。其中Rpfd2組產(chǎn)生的抗體水平最高，提示其啟動感染宿主體液免疫能力優(yōu)于BCG。使用Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白作為抗原，均能被3種抗體識別，且親合程度趨于一致，說明Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白產(chǎn)生的特異性抗體同Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白之間存在交叉免疫反應(yīng)，提示該三種蛋白產(chǎn)生的特異性抗體有可能同時封閉MTB的5種Rpf樣蛋白，從而達(dá)到抑制休眠M(jìn)TB復(fù)蘇和生長作用。 2.3Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的細(xì)胞免疫應(yīng)答 將Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白采用同源加強(qiáng)免疫的方法免疫小鼠，測定小鼠外周血中IFN-γ和IL-2表達(dá)水平。用MTB毒株H37Rv攻擊免疫小鼠，測定小鼠外周血中IFN-γ和IL-2表達(dá)水平。結(jié)果顯示Rpfd、Rpfd1、Rpfd2具有誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生以IFN-γ、IL-2分泌量明顯增加為主的Th1型免疫應(yīng)答。H37Rv攻擊小鼠后，Rpfd發(fā)揮其促細(xì)菌生長作用，使小鼠體內(nèi)MTB大量生長，巨噬細(xì)胞吞噬大量MTB后，崩解死亡導(dǎo)致IFN-γ含量明顯下降；而Rpfd1、Rpfd2無促細(xì)菌生長作用，巨噬細(xì)胞吞噬MTB后，未達(dá)到結(jié)核菌負(fù)荷過載，巨噬細(xì)胞殺滅MTB，同時促進(jìn)IFN-γ分泌，故IFN-γ量增加。Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白免疫小鼠后，刺激小鼠產(chǎn)生IL-2水平明顯升高，高于BCG免疫組；MTB攻擊免疫小鼠后，三組蛋白免疫組小鼠血清中IL-2檢測量均有下降，Rpfd2蛋白免疫組小鼠血清中IL-2下降尤為明顯，提示IL-2因刺激機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞增殖，強(qiáng)化細(xì)胞保護(hù)性免疫而消耗，Rpfd2組更為明顯。 3結(jié)論 Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白具有啟動宿主體液免疫功能及增強(qiáng)宿主細(xì)胞免疫功能的雙重作用，可通過激發(fā)宿主細(xì)胞免疫防御MTB的感染，通過刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體封閉體內(nèi)或體外來源的Rpf樣物質(zhì)、從而抑制體內(nèi)處于休眠狀態(tài)的MTB的復(fù)蘇，可成為預(yù)防及治療MTB感染的免疫新策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R52

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2464629