【摘要】：背景： 弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，可以感染幾乎所有的溫血?jiǎng)游铮瑫?huì)引起世界范圍內(nèi)傳播的人獸共患病。免疫功能正常人群感染弓形蟲不會(huì)出現(xiàn)明顯癥狀，但免疫功能低下或缺陷者感染弓形蟲則會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥，目前弓形蟲感染已經(jīng)成為AIDS和器官移植患者重要死亡因素之一�；蚪M數(shù)量特征分析、轉(zhuǎn)基因弓形蟲實(shí)驗(yàn)及菌株雜交實(shí)驗(yàn)均證明ROP18能提高弓形蟲的增殖速率，對(duì)感染動(dòng)物有致死作用，因此，ROP18是弓形蟲重要的毒力因子，，本研究采用酵母雙雜交方法篩選與ROP18相互作用的宿主蛋白，通過(guò)免疫沉淀、GST-pull down、酵母共轉(zhuǎn)以及免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)ROP18與宿主NF-κB p65的相互作用，提示ROP18可能通過(guò)宿主NF-κB發(fā)揮其致病作用，為弓形蟲病致病機(jī)制研究提供依據(jù)。 目的： 采用酵母雙雜交法篩選與弓形蟲毒力因子ROP18相互作用的蛋白及ROP18與NF-κB p65相互作用的鑒定，為弓形蟲致病機(jī)制研究提供依據(jù)。 方法： 本實(shí)驗(yàn)分為兩部分：（1）RT-PCR擴(kuò)增弓形蟲RH株速殖子ROP18基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后插入酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7中，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母AH109菌株中，檢測(cè)誘餌載體是否有毒性和自激活作用，利用酵母雙雜交從人胚胎腦cDNA文庫(kù)中篩選與ROP18相互作用的蛋白；（2）RT-PCR擴(kuò)增弓形蟲RH株速殖子ROP18基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后插入PCR blunt II Topo vector構(gòu)建pROP18，從pROP18擴(kuò)增出ROP18編碼序列，將純化的PCR產(chǎn)物克隆至pTUB8-mycGFPPftailTY，構(gòu)建pTUB8-ROP18-TY質(zhì)粒，將質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染弓形蟲RH株，弓形蟲懸浮液轉(zhuǎn)移到長(zhǎng)有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，用含25μg/ml霉酚酸和50μg/ml黃嘌呤的DMEM篩選高表達(dá)ROP18的弓形蟲RH株，收集蟲體，腹腔注射昆明小鼠，免疫熒光檢測(cè)ROP18在轉(zhuǎn)基因弓形蟲株中的表達(dá)，吉姆薩染色比較RH株與高表達(dá)ROP18的RH株的細(xì)胞增殖速率，酵母共轉(zhuǎn)、GST-pull down及免疫共沉淀證明ROP18與p65之間存在相互作用，免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)觀察ROP18與宿主p65共定位。 結(jié)果： 1.ROP18相互作用的宿主蛋白的篩選 1）酶切鑒定表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2）用玻璃珠（美國(guó)Sigma公司）法提取轉(zhuǎn)了質(zhì)粒pGBKT7-ROP1825 251aa的酵母蛋白， WB檢測(cè)顯示ROP18蛋白表達(dá)，陰性組不表達(dá)。 3）發(fā)現(xiàn)ROP18全長(zhǎng)具有自激活功能，因此用ROP1825-251aa為誘餌，篩選獲得一系列與ROP18相互作用的宿主蛋白：NF-κB p65蛋白、DNA損傷特異性結(jié)合蛋白1（DDB1）、轉(zhuǎn)錄激活因子ATF6β、torsinA相互作用蛋白1（TOR1AIP1）、溶質(zhì)運(yùn)載蛋白3（SLC3A2）、Derl樣域家族成員2（DERL2）、酪氨酸硫化轉(zhuǎn)移酶2（TPST2）、OCIA結(jié)構(gòu)域蛋白1（OCIAD1）和整聯(lián)蛋白β1（integrinβ1）。 2.ROP18與NF-κB p65相互作用的鑒定 1）將轉(zhuǎn)基因弓形蟲感染后的細(xì)胞固定和抽提以后，染Ty1鼠mAb（綠色）、DAPI（藍(lán)色），重疊圖像表明在弓形蟲頂端的棒狀體附近有ROP18蛋白表達(dá)。 2）吉姆薩染色證明ROP18過(guò)表達(dá)弓形蟲株較RH株弓形蟲增殖快，ROP18能夠促進(jìn)弓形蟲在細(xì)胞內(nèi)的增殖。 3）酵母共轉(zhuǎn)：將p65構(gòu)建到pGADT7載體，然后與ROP18的酵母表達(dá)載體共轉(zhuǎn)至酵母AH109菌株，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal培養(yǎng)基上驗(yàn)證，結(jié)果表明p65是通過(guò)二聚化結(jié)構(gòu)域與ROP18相互作用。 4）細(xì)胞免疫熒光：將ROP18過(guò)表達(dá)的弓形蟲感染后的HFF細(xì)胞固定和抽提以后，共染Ty1鼠mAb（綠色）、p65兔mAb（紅色）、DAPI（藍(lán)色），重疊圖像表明弓形蟲ROP18和宿主NF-κB p65共定位于宿主細(xì)胞質(zhì)。 5）免疫共沉淀：將ROP18-Δ27-GFP與GFP分別轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，用GFP抗體沉淀細(xì)胞裂解液中的p65，免疫沉降物經(jīng)SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移到NC膜上，分別用GFP和p65抗體雜交，發(fā)現(xiàn)p65存在于ROP18-Δ27-GFP的免疫復(fù)合物中，因此p65和ROP18可以在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用。 6）GST-pull down：將純化后的帶GST標(biāo)簽的ROP18蛋白與帶HIS標(biāo)簽的p65-M蛋白進(jìn)行GST-pull down實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)p65-M能與ROP18直接相互作用，進(jìn)一步驗(yàn)證p65是通過(guò)二聚化結(jié)構(gòu)域與ROP18相互作用。 結(jié)論： （1）通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選出與弓形蟲毒力因子ROP18相互作用的多種宿主蛋白。 （2）高表達(dá)毒力因子ROP18的轉(zhuǎn)基因弓形蟲可遺傳系統(tǒng)構(gòu)建成功。 （3）ROP18與NF-κB p65相互作用。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R531.8

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 鄭斌,詹希美;弓形蟲微線體蛋白的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));2005年05期

2 劉苗苗;周鵬;朱興全;;弓形蟲棒狀體蛋白的研究進(jìn)展[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2008年05期

本文編號(hào)：2450836